[发明专利]一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D和试剂E；

所述的试剂A的组成成分为：引物P1s 0.4 μM；引物P1a 0.4 μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl₂ 3mM；KCl 100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温20 0.005%；甘油0.5%；

所述的试剂B的组成成分为：引物P2s 0.4 μM；引物P2a 0.4 μM；DNA聚合酶0.1U/μl；dATP、dCTP、dTTP和dGTP各500μM；MgCl₂ 3mM；KCl 100mM，pH值为8.3的Tris-HCl20mM；吐温20 0.005%；甘油0.5%；

所述的试剂C为溶质是柠檬酸钠、枸橼酸钠和乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种的溶液，试剂C的浓度0.1%-0.5%；

所述的试剂D为去离子水；

所述的试剂E为无乳链球菌cfb基因或含cfb基因的质粒，该试剂E中cfb基因的拷贝数为1×10⁸拷贝/ml；

所述的试剂A中引物P1s的序列为：5’- TGACGACCTTTTGGACAAGTAGTAA-3’，引物P1a的序列为5’- CGACAGCATCACACGAAAAATACA-3’；

所述的试剂B中引物P2s的序列为：5’- ATGATGTATCTATCTGGAACTCTAGTG -3’，引物P2a的序列为5’- CGCAATGAAGTCTTTAATTTTTC -3’；

所述罗非鱼无乳链球菌免培养半定量检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：

1．绘制标准反应对照表：

1.1．第一轮PCR反应：

取一定量的试剂D和试剂E混合，配制成cfb基因拷贝数分别为2×10⁷拷贝/ml、2×10⁶拷贝/ml、2×10⁵拷贝/ml、2×10⁴拷贝/ml、2×10³拷贝/ml、2×10²拷贝/ml、0拷贝/ml的cfb基因溶液；

抽取健康罗非鱼新鲜血液，立即与试剂C按1:1的比例混合均匀，再与上述的cfb基因溶液分别等体积混合得到混合溶液；

分别吸取上述混合溶液1μl作为模板，分别与12.5μl试剂A和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行第一轮PCR反应，反应条件为：

94℃预变性5 min；

94℃变性30s；

50℃退火30s；

72℃延伸30s；

反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s 和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25-35次；

将该PCR反应液共制备3份进行PCR反应，除每份PCR反应液的循环次数分别为25，30，35外，其他条件均相同；

1.2．第二轮PCR反应：

吸取第一轮PCR反应后的PCR反应液1μl，分别与12.5μl试剂B和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行PCR反应，反应条件为：

94℃预变性5 min；

94℃变性30s；

50℃退火30s；

72℃延伸30s；

反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s 和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25次；

1.3．电泳并绘制标准反应对照表：

第二轮PCR反应完成后，取5μl反应后的溶液进行电泳，并观察结果，在350 bp处出现DNA条带者为阳性结果，根据实验结果绘制标准反应对照表，阳性结果标记“+”，阴性结果标记“-”；

2．进行样品反应：

2.1．第一轮PCR反应：

抽取未死亡的健康或患病罗非鱼的新鲜血液，立即与试剂C按体积比为1:1的比例混合均匀得到混合液，吸取上述混合液1μl作为模板，分别与12.5μl试剂A和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行第一轮PCR反应，反应条件为：

94℃预变性5 min；

94℃变性30s；

50℃退火30s；

72℃延伸30s；

反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s 和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25-35次；

将该PCR反应液共制备3份进行PCR反应，除每份PCR反应液的循环次数分别为25，30，35外，其他条件均相同，此外，另取1μl去离子水3份作为模板，同时进行上述反应作为阴性对照；

2.2．第二轮PCR反应：

吸取第一轮PCR反应后的PCR反应液1 μl，分别与12.5μl试剂B和11.5μl的去离子水混合，制成总体积为25μl的PCR反应液，进行第二轮PCR反应，反应条件为：

94℃预变性5 min；

94℃变性30s；

50℃退火30s；

72℃延伸30s；

反应过程中，在反应条件为94℃变性30s、50℃退火30s 和72℃延伸30s时进行循环反应，循环次数为25次；

2.3．电泳并绘制标准反应对照表：

第二轮PCR反应完成后，取5μl反应后的溶液进行电泳，在350 bp出现DNA条带者为阳性结果，观察并记录结果，对照标准反应结果即可判断所抽取罗非鱼血液中无乳链球菌的浓度。