[发明专利]抑制烟曲霉生物膜形成的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及烟曲霉生物膜，具体涉及一种抑制烟曲霉生物膜形成的方法。

背景技术

烟曲霉是一种条件致病菌，可造成免疫低下患者严重的感染，能引起肺曲霉球、变应性支气管肺曲霉病及侵袭性曲霉病（IA）等多种疾病。近年来烟曲霉对免疫低下患者的感染率在真菌中仅次于念珠菌，并且随着免疫低下患者数量的增多，侵袭性曲霉病的发病率逐渐升高，调查发现，侵袭性曲霉病在重症加强护理病房（ICΜ）的发病率由0.3%上升至5.8%，并且死亡率高达30-100%。临床上能用于治疗侵袭性曲霉病的药物有限，尽管新型的药伏立康唑已经应用于临床多年，但是侵袭性曲霉病的死亡率并未见明显降低，而且伏立康唑耐药的烟曲霉菌株已经出现，并呈现出增多趋势，而耐药菌株和敏感菌株引起的死亡率分别为88%和48%，现今如何控制耐药的烟曲霉感染成为了临床面临的巨大难题。研究表明，烟曲霉形成生物膜是其耐药的机制之一，一旦形成生物膜，烟曲霉对药的耐药性将提高几十至上千倍。生物膜是是一种附着在组织的表面、由自身产生的胞外基质包围的有结构的菌细胞群体，是相对于游离状态的菌细胞而言的另一种微生物的生存方式。烟曲霉的生物膜由菌丝及包裹住菌丝的胞外基质组成，由于，菌丝被胞外基质所包裹，药物难以渗透进去作用于菌丝，因此烟曲霉菌丝细胞得以逃避药和机体免疫的伤害，从而能形成持续的感染源造成慢性而且耐药的感染。烟曲霉生物膜中的菌丝细胞耐药性随着生物膜成熟度的增加而增加，因为成熟期的生物膜比早期生物膜的胞外基质更致密，保护作用更强，因而对于烟曲霉生物膜相关感染，越早治疗效果越好，如果能在生物膜形成之前就能用药抑制其形成，那么烟曲霉的耐药性将不会增加。然而目前尚未发现能有效抑制烟曲霉生物膜形成的药物，因此研发出能有效抑制烟曲霉生物膜形成的新药对治疗烟曲霉生物膜相关感染意义重大。

发明内容

本发明公开异绿原酸A具有抑制烟曲霉生物膜形成的作用，就是在烟曲霉生物膜形成之前就用药干预，抑制生物膜的形成，以达到预防用药的目的。为实现上述目的所用的技术方案为：一种抑制烟曲霉生物膜活性的方法，包括制备药物、收集菌株、制备载体、制备孢子悬液、药物敏感试验、抑制烟曲霉生物膜和电镜扫描，具体操作步骤如下：

（1）制备药物 取400~500mg异绿原酸A用3~6ml 100%的二甲亚砜溶解，配制成浓度为90000~100000μg/ml的溶液，于-20℃~-25℃储存；

（2）收集菌株 收集烟曲霉菌株，用结晶紫法选出形成生物膜能力最强的菌株作为受试菌株，质控菌株为ATCC22019近平滑念珠菌；

（3）制备载体 将1×1 cm²聚氯乙烯薄片用75%的乙醇浸泡15-20min，后用无菌生理盐水浸洗，将上面的乙醇彻底洗净后作为载体，备用；

（4）制备孢子悬液 将步骤（2）收集的菌株接种到PDA培养皿，置于35~37℃生化培养箱进行复苏，后转至另一个PDA培养皿并置于35~37℃生化培养箱活化3~5天后，用5~10ml含有0.025%吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~30ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~3×10⁶·孢子·ml-1，再用RPMI-1640液体培养基稀释50倍，得到2倍终浓度的孢子悬液；

（5）药物敏感试验 微量液基稀释法，在无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔加入步骤（4）制备的孢子悬液，再将步骤（1）制备的异绿原酸A置于无菌的96孔细胞培养板的第1至第10孔，第1孔加入量为100μl，第2~10孔依次倍比稀释至二倍终浓度，第11孔为步骤（4）制备孢子悬液的生长对照孔，第12孔为MOPS缓冲的RPMI-1640液体培养基，静置于35~37℃培养48h；获得异绿原酸A最低抑菌浓度MIC；最低抑菌浓度（MIC）的判定：肉眼观察判断终点：96孔培养板各个孔充分混匀之后与生长对照孔比较，100%生长抑制所对应的最低药物浓度为此药物的MIC；

（6）抑制烟曲霉生物膜 将步骤（4）制备的含有孢子悬液的载体水平放置于24孔板内，按照步骤（5）获得的MIC浓度，将亚抑菌浓度的异绿原酸A放入孔内，每个孔加入的量为1ml，静置于35~37℃的生化培养箱避光培养48~50h，间隔24h用相同药物换液；