[发明专利]一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因组提取的破壁方法，尤其是丝状真菌基因组提取过程必要的破壁方法。

背景技术

丝状真菌广泛存在于自然界中，并且具有多种多样的功能，因此丝状真菌的研究经久未衰，反而越来越引起研究者的关注。微生物研究的第一步就是进行物种鉴定，真菌的传统分类鉴定依据主要采用培养时的形态特征，而培养特征差异非常显著，从而影响分类的准确性。真菌的现代分类鉴定则是结合形态学、生理学以及 DNA 分子水平等多方面进行综合鉴定。DNA 提取是分子水平鉴定的第一步，有关丝状真菌基因组 DNA 提取的方法有很多。有效地提取丝状真菌基因组的关键在于破坏丝状真菌细胞壁的程度。丝状真菌基因组 DNA 提取方法大体相似，差别主要在于采用什么方法破坏丝状真菌细胞壁。真菌细胞破壁的方法：1）经典的液氮研磨法。需要专用容器装载购置的液氮，并且在研钵中研磨需要较多的菌丝体，同时由于研钵的敞开面积较大容易引起杂菌污染；液氮容易冻伤皮肤，一些地方液氮不容易获得而受到限制。2）液氮冻融（和玻璃珠振荡）法。该方法使用液氮，增加了成本及设备要求。3）酶解法。用于丝状真菌破壁的酶比较昂贵，在处理大量样品时很不经济。4）化学试剂 (氯化苄) 法。化学试剂存在环保上的隐患。

为了得到高质量 DNA 而发展起来的方法一般耗时长，费用高，并需要一些特殊的设备，一般的生物学实验室很难满足其要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，能方便、快捷地破碎丝状真菌的细胞壁，采用常用的离心管和自制普通玻璃棒。采用该方法所获得的高分子量 DNA 用于PCR等分析，适用于进行分子生物学的研究。

本发明是这样实现上述目的的：一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，该方法包括以下步骤：

1）将丝状真菌接种于NBRIP(National Botanical Research Institute’s phosphate medium)、土豆培养基液体培养基中进行培养；

2）将步骤1）中培养的丝状真菌用无菌牙签挑取置于离心管中离心，倒掉上清液，收集菌体，再将菌体与灭菌双蒸水混合菌丝后离心（12000 rpm, 10 min），弃上清，保留真菌菌丝；

3）在步骤2）离心后的含菌丝体离心管中加入DNA提取缓冲液，混合菌体和提取缓冲液；

4）将步骤3）处理得到的菌体立即放入-28~-18 ℃冰箱中，放置1~2 h冻结；

5）将步骤4）得到已经冻结的菌体，用灭菌的玻璃棒挤压破壁，重复步骤4）和步骤5）3~7次（冻结-玻璃棒破碎），所述的玻璃棒手握端包裹10-15层灭菌脱脂纱布，方便用力、避免损伤手心；

6）将步骤5）中得到的菌体破碎液的一半转移到另一支离心管中，然后都置于65 ℃ 恒温30 min，加入等体积的混合液 Ｉ(苯酚：氯仿：异戊醇 = 25：24：1)，充分混匀，离心（12000 rpm, 10 min），吸取600~700ｕL上清液移入到另一支离心管中，加入等体积的混合液ＩＩ (氯仿：异戊醇 = 24：1)，充分混匀，离心（12000 rpm, 10 min）；

7) 将步骤6）得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积 -20 ℃ 预冻的无水乙醇，离心（12000 rpm, 10 min），弃上清，用 75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到基因组DNA可用于PCR扩增等，对于颜色很深难以用混合液去除颜色物质时，将基因组DNA沉淀后再用真菌提取试剂盒分离纯化。

本发明提供的一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，由于采用-20 ℃的普通冰箱和自制的玻璃棒，几乎所有微生物学实验室都有配置，避免了特殊设备的需求。不使用液氮可以减少对液氮来源的依赖，并减少了研钵研磨时的杂菌污染。该方法操作方便、经济实惠，能方便、快捷地获得丝状真菌基因组DNA，可以推广使用。

具体实施方式

实施例1

一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，该方法包括以下步骤：