[发明专利]一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法

权利要求书

1.一种丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，包括以下步骤，

1）培养：将丝状真菌接种于液体培养基中，25~30℃环境下，震动培养1~2天，静止培养2~7天；

2）收集菌体：挑取丝状真菌菌丝置于离心管中离心，倒掉上清液，收集菌体，再将菌体与灭菌双蒸水混合菌丝后离心，弃上清，保留真菌菌丝；

3）加提取液：在步骤2）离心后的含菌丝体离心管中加入DNA提取缓冲液，混合菌体和提取缓冲液；

4）冻结：将步骤3）处理得到的菌体放入-28~-18 ℃冰箱中，放置1~2 h冻结；

5）破碎丝状菌体：将步骤4）得到已经冻结的菌体，用灭菌的玻璃棒挤压破壁；

6）收集基因组DNA溶液：重复步骤4）和步骤5）3~7次后，将破壁后得到的菌体破碎液的一半转移到另一支离心管中，置于65 ℃ 恒温30 min，加入等体积的混合液Ｉ，充分混匀，离心，吸取600~700ｕL上清液移入到同一支的离心管中，同时加入等体积的混合液ＩＩ，充分混匀，离心；

7) 沉淀基因组DNA：将步骤6）得到的上清液移入到新的离心管中，并加入2.5倍体积 -20 ℃ 预冻的无水乙醇，离心，去上清液，用 75 %的酒精洗涤沉淀2次，挥干后得到丝状真菌基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于：步骤1）中，所述的液体培养基为NBRIP (National Botanical Research Institute’s phosphate medium)或土豆培养基。

3.根据权利要求2所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于：所述的NBRIP培养基每升含有：10 g C₆H₁₂O₆，5 g Ca₃(PO₄)₂，5 g MgCl₂·6H₂O， 0.25 g MgSO₄·7 H₂O，0.2 g KCl，0.1 g (NH₄)₂SO₄，培养基pH为7.0～7.２；所述的土豆培养基含20% 土豆，2% 蔗糖。

4.根据权利要求1所述的一种用于丝状真菌基因组DNA提取的简便破壁方法，其特征在于：步骤2）中，将收集的菌丝体用蒸馏水漂洗1~2次，以除去培养基及真菌的代谢产物。

5.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于：步骤5）中玻璃棒灭菌，手握端包裹10~15层灭菌脱脂纱布。

6.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于：步骤6）中，混合液Ｉ为V_苯酚：V_氯仿：V_异戊醇 = 25：24：1；混合液ＩＩ为V_氯仿：V_异戊醇 = 24：1。

7.根据权利要求1所述的丝状真菌基因组DNA提取的破壁方法，其特征在于：所述的离心速率为12000 rpm，离心时间为10 min。