[发明专利]具有延长的体内半衰期的因子VIIa-聚唾液酸结合物

说明书

本申请是申请日为2007年12月14日、申请号为200780046301.6(PCT/US2007/087553)的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求在2006年12月15日申请的美国临时专利申请No.60/875,217的优先权。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质构建体，其包含结合于含有1-4个唾液酸单元的链的碳水化物部分的凝血因子VIIa(FVIIa)。本发明还涉及用于延长哺乳动物血液中凝血蛋白、尤其是FVIIa的体内半衰期的方法，所述哺乳动物患有与至少FVIIa、因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)功能性缺陷或缺乏有关的出血病症。

背景技术

凝血级联被分成三个不同的部分：内在的、外在的、以及共同的路径(Schenone等，Curr Opin Hematol.2004；11：272-7)。该级联涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅助因子。当需要时，无活性的酶原前体被转化为活性形式，从而转换级联中下一个酶。

内在路径需要凝血生的因子VIII、IX、X、XI、以及XII。当激肽释放酶原、高分子量激肽原、因子XI(FXI)和因子XII(FXII)暴露于带负电的表面时，内在路径开始启动。还需要钙离子和由血小板分泌的磷脂。

当血管的脉管内腔受损伤时，外在路径被启动。细胞膜糖蛋白组织因子被暴露，然后结合于循环性的因子VII(FVII)，并且结合于其较小的在先存在量的活化形式FVIIa。这种结合可以促进FVII全部转化为FVIIa，并且随后当钙和磷脂存在时、因子IX(FIX)转化为因子IXa(FIXa)，而因子X(FX)转化为因子Xa(FXa)。通过使FVII的结合位点更接近于底物(FX和FIX)、并且通过诱导构型变化，导致FVIIa与组织因子的连接增强了蛋白质水解的活性，其增强了FVIIa的酶活性。通过外在路径的FX活化速率比通过FIXa、FVIIIa、磷脂、以及钙离子的(内在)路径获得的活化速率大约慢50倍。

FX的活化是两种路径的共同点。随同磷脂和钙，因子Va(FVa)和Xa将凝血酶原转化为凝血酶(凝血酶原酶复合物)，然后凝血酶裂解纤维蛋白原，从而形成纤维蛋白单体。该单体发生聚合，从而形成纤维蛋白链。因子XIIIa(FXIIIa)使这些链彼此共价结合，从而形成刚性网格。

FVII向FVIIa的转化也是通过由包括凝血酶、FIXa、FXa、因子XIa(FXIa)、以及因子XIIa(FXIIa)在内的许多蛋白酶的催化来进行的。对于级联早期的抑制，组织因子路径抑制剂靶向FVIIa/组织因子/FXa产物复合物。

FVII(亦称稳定因子或者前转化素)是维生素K-依赖性的丝氨酸蛋白酶糖蛋白，在止血和凝血中扮演着关键角色(Eigenbrot，Curr Protein Pept Sci.2002；3：287-99)。

FVII是在肝脏中合成的，并且被作为48kD的单链糖蛋白被分泌。FVIIa与所有的维生素K-依赖性的丝氨酸蛋白酶糖蛋白共同分享类似的蛋白质结构域结构，该结构域结构包含具有9-12个决定着蛋白质与类脂膜的相互作用的残基的氨基端γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域、羧基端丝氨酸蛋白酶结构域(催化结构域)、以及两种含有介导着与组织因子的交互作用的钙离子结合位点的表皮生长因子状结构域。

γ-谷氨酰基羧化酶催化在分子的氨基端部分中的Gla残基的羧基化。该羧化酶取决于其作用的维生素K的还原形式，该还原形式被氧化成环氧化物形式。维生素K环氧化物还原酶被要求将维生素K的环氧化物形式反向转化回还原形式。

大部分的FVII在血浆中呈酶原形式循环，并且这种形式的活化导致在精氨酸152和异亮氨酸153之间的肽键的裂解。得到的活化的FVIIa包含NH₂-衍生的轻链(20kD)和COOH末端衍生的经由单一二硫键(Cys135至Cys262)连接的重链(30kD)。轻链含有细胞膜结合性Gla结构域，而重链含有催化结构域。