[发明专利]含有绿色荧光蛋白基因的表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种含有绿色荧光蛋白基因的表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65-67位氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成发光团，经共价键连接而成为羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。其发光团的形成不具有专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。

绿色荧光蛋白（GFP）在生物学领域中常被用作报导基因，是一种理想的示踪标记，已经在生物技术、细胞生物学、转基因动物、环境工程、微生物学等领域得到广泛的应用。利用绿色荧光蛋白特有的发光机制，可将GFP作为蛋白标签（protein tagging），就是利用DNA重组技术，将目的基因与GFP构成融合基因，转染或转化至合适的细胞进行表达，而后借助荧光显微镜观察细胞内活体中标记的蛋白质。因为GFP只有238个氨基酸，相对较小，所以将其与其他蛋白融合后不影响其自身的发光功能，利用GFP的这一特性，已经加深了对细胞内一些过程的了解，如发育和信号转导、细胞分裂、染色体复制和分裂等。利用GFP来检测目标蛋白的定位提供了一种对细胞内生理过程进行观察的新方法。

鉴于绿色荧光蛋白可以作为报告基因，且在生物技术中被广泛应用，但现有的带有目的蛋白基因片段的表达载体在应用中需要经过挑取菌落和基因测序步骤来确定是否为正确的阳性克隆子，需要进行大量的盲目挑斑以及PCR鉴定的工作，费时费力。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供一种带有绿色荧光蛋白的表达载体及该表达载体的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现：

一种含有绿色荧光蛋白基因的表达载体，所述绿色荧光蛋白基因为sfGFP基因，所述sfGFP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种含有绿色荧光蛋白基因的表达载体的构建方法，包括以下步骤：

合成核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因；

合成带有酶切位点的引物，并在此引物的引导下，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sfGFP基因为模板进行PCR扩增，得到带有酶切位点的核苷酸序列；

将空载质粒以及所述PCR扩增得到的带有酶切位点的核苷酸序列分别进行双酶切并回收酶切后片段，用DNA连接酶连接酶切后片段，并用于转化大肠杆菌；

用含有与空载质粒中抗性基因相对应的抗生素的LB固体培养基进行筛选，挑取发绿色荧光的克隆子检测载体序列，通过基因测序检测正确的载体即为所述的含有绿色荧光蛋白基因的表达载体。

在上述技术方案中，所述空载质粒为pET-28a(+)或pGEX-6P-1。

在上述技术方案中，所述大肠杆菌为大肠杆菌RosettaBlue(DE3)。

以上所述含有绿色荧光蛋白基因的表达载体在阳性克隆子筛选上的应用，步骤如下：

合成目的基因；

合成带有酶切位点的引物，并在此引物的引导下，以合成的目的基因序列为模板，进行PCR扩增得到带有酶切位点的目的核苷酸序列；

将所述的表达载体和PCR扩增得到带有酶切位点的目的基因序列分别进行双酶切，回收酶切片段，用DNA连接酶连接酶切后的表达载体片段和目的基因片段，并转化大肠杆菌，用含有与权利要求1中所述的表达载体具有的抗性基因相对应的抗生素的LB固体培养基进行筛选，挑取不发光的斑，即为带有目的基因序列的克隆子。

本发明利用了Superfolder GFP（sfGFP）能在各种条件下完成超折叠并发光的特性，其发光能力和发光强度优势明显强于普通GFP、EGFP等蛋白，为EGFP的1.6倍，肉眼即可观察到明显的绿色荧光，因此可以方便蛋白表达克隆过程中阳性克隆子的筛选，有利于快速、准确的对阳性克隆子进行筛选。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pET-28a(+)-sfGFP表达载体结构示意图。

图2为本发明实施例提供的pGEX-6P-1-sfGFP表达载体结构示意图。

图3为本发明实施例提供的利用pET-28a(+)-sfGFP表达载体构建的pET-28a(+)-β2M载体结构示意图。

图4为本发明利用pGEX-6P-1-sfGFP表达载体构建pGEX-6P-1-β2M载体结构示意图。

具体实施方式