[发明专利]一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，尤其是检测乙型肝炎病毒突变（A1C和G1899A）的试剂盒。

背景技术

原发性肝癌是世界上第六大常见的恶性肿瘤，全球每年约有63万新发肝癌病例，其中55%来自中国。肝癌预后极差，年死亡人数约为60万，在各类肿瘤死亡原因中排名第三。乙肝相关肝癌的中位生存时间约为16个月，五年生存率介于15%-26%之间。目前肝癌治疗手段主要有手术切除、肝移植及介入治疗，但术后复发率高，改善预后效果不明显。肝癌预后差的主要原因是大多数患者就诊时已发展为肝癌中晚期，失去了最佳的治疗时期。研究证明，早期诊断和治疗肝癌能够显著改善预后，患者五年生存率可达64.8%。

在中国，大多数肝癌发生于乙肝病毒感染导致的慢性肝炎及肝硬化基础上，缺乏明显的早期症状及敏感的早期筛查手段是导致早期肝癌漏诊、误诊的主要原因。目前临床诊断肝癌的金标准仍为活检病理，但由于其是有创性检查，且可能导致肝癌转移，故不能反复进行。B超作为一种方便、低廉、无创的检查手段，诊断中晚期肝癌的敏感性、特异性及准确度都较高，适合大规模人群筛查，但B超发现早期肝癌的能力有限，不易与肝硬化结节区别，而且很大程度上取决于肿瘤生长部位及检查者的经验，故限制了其在早期肝癌诊断中的应用。普通CT因为扫描时间长、扫描层较厚且易受呼吸运动影响等，易出现假阳性或假阴性。多层螺旋CT（MSCT）扫描速度快、层面薄，提高了小病灶的检出率，同时可清楚显示肝癌的血供情况，但费用较昂贵，不适于大规模人群筛查。血管造影对小肝癌检出率高，但其有创性及高费用限制了筛查价值。血清学检查因其快速、简便、费用低、无痛苦等优势而成为大规模筛查的主要工具，现临床诊断肝癌主要依靠AFP（>400ng/ml），其诊断乙肝后肝癌的敏感性约为70-75%。由于AFP表达量与肝癌大小成正相关，故常难以检出早期微小肝癌。AFP在急性肝炎、肝破裂、肝外伤及生殖系统肿瘤中均可升高，故其诊断特异性也不尽人意。其他血清标志物如Des-γ-carboxy prothrombin(DCP)（异常凝血酶原）、α-L-Fucosidase（α-岩藻糖苷酶）以及γ-GT（γ谷氨酰转肽酶）等虽有一定的参考价值，但敏感性及特异性均较低。因此，我们迫切需要找到一种新的高度敏感和特异的早期诊断标志。

目前常用的突变检测方法为基因直接测序，但该方法费时、费力，敏感性低，达不到早期快速诊断的目的。因而，需要一种快速检测的方法用于流行病学现场调查和实验室快速检测。

反向杂交线性探针（reverse hybridization line probe assay）技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的突变部位设定多个可能的探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行结果观察，简便实用，特异性高，灵敏度强。反应在杂交炉内可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及现场快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供乙型肝炎病毒突变位点（A1C、G1899A）在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，并提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒。

本发明人发现，在乙型肝炎病毒特定的区域某些特定位点的突变与乙型肝炎病毒阳性肝病，尤其是肝细胞癌的发生具有重要联系。本发明人通过研究发现，乙肝病毒BCP区的G1899A和A1C突变能够很好的将HCC患者与非肝癌的乙肝患者区分开来，OR值分别高达4.44和15.4，95%可信区间分别为2.91-6.76，6.15-38.56。因此，检测乙肝感染者的这两个关键位点的联合突变，能够预测肝癌的发生，并对患者进行早期筛检和诊断。

本发明的第一方面，是提供了一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，所述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突变，具体是A1C的第一位碱基从A变成C,G1899A的第1899位碱基从G变成A。

本发明的第二方面，是提供了一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，所述的乙肝病毒联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的试剂盒的组成包括：

1.PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

将P1和P2等量混合组成PCR引物Ⅰ，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引物；

P3和P4等量混合组成PCR引物Ⅱ，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物；