[发明专利]一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒突变位点在制备肝癌早期诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒突变位点是乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合突变，其中A1C的第一位碱基从A突变成C，G1899A的第1899位碱基从G突变成A。

2.一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的乙肝病毒联合变异是指乙肝病毒BCP区的A1C和G1899A联合发生突变，所述的试剂盒的组成包括：

（A）  PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ

将P1和P2等量混合组成PCR引物Ⅰ，为含G1899A位点区域巢式PCR第一轮引物；

P3和P4等量混合组成PCR引物Ⅱ，为G1899A位点区域巢式PCR第二轮引物；

P5和P6等量混合组成PCR引物Ⅲ，为含A1C位点区域巢式PCR第一轮引物；

P7和P8等量混合组成PCR引物Ⅳ，为含A1C位点区域巢式PCR第二轮引物；

P1至P8序列如表1所示，其中P3和P7的5’端使用生物素标记；

各引物序列如下：

编号  引物序列

（B）  杂交膜

杂交膜上固定的探针序列如下：

（C）  预杂交液；

（D）  杂交液；

（E）  抗体；

（F）  洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；

（G）  缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ；

（H）  显色液；

（I）  终止液。

3.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中，P1至P8每一条引物的浓度为5μM；P1和P2等量混合；P3和P4等量混合；P5和P6等量混合；P7和P8等量混合。

4.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的杂交膜，各探针的浓度为5mmol/L，用量为4μl。

5.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，将各探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上，40μl反应体系如下：

6.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ如下：

20×SSC

3mmol/L Nacl

0.3mol/L柠檬酸三钠

洗脱液Ⅰ：6×SSC，0.5%SDS；

洗脱液Ⅱ：5×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅲ：1×SSC，0.1%SDS；

洗脱液Ⅳ：0.1×SSC,0.1%SDS。

7.根据权利要求2所述的一种检测乙肝病毒联合变异预测肝癌发生的试剂盒，其特征在于，所述的预杂交液如下：5×SSC，0.5%Triton X100；

所述的缓冲液Ⅰ如下：0.15mol/L Nacl，100mmol/L Tris，pH7.5；

所述的缓冲液Ⅱ如下：0.15mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白，pH7.5；

所述的缓冲液Ⅲ如下：0.1mol/L Nacl，0.1mol/L Tris，3%牛血清白蛋白，50mmol/L Mgcl₂，pH9.5；

所述的抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体；

所述的显色液：NBT/BCIP混合显色液；

所述的终止液：0.2mmol/L EDTA。

8.一种利用如权利要求1所述的试剂盒检测乙肝病毒联合变异的检测方法，其特征在于，该检测方法包括下列步骤：

（A）提取乙肝病毒DNA，使用引物Ⅰ和Ⅱ分别进行巢式PCR扩增；

（B）将杂交膜放入100ml洗脱液Ⅰ中，68℃漂洗30min；

（C）68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

（D）将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

（E）将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68℃杂交120min；

（F）用50ml洗脱液Ⅱ于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（G）用50ml洗脱液Ⅲ于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（H）用50ml洗脱液Ⅳ于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

（I）缓冲液Ⅱ中42℃封闭40min；

（J）10min缓冲液Ⅰ中加入抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

（K）缓冲液Ⅰ中室温漂洗2次，每次15min；

（L）缓冲液Ⅲ中室温漂洗2次，每次15min；

（M）10ml缓冲液Ⅲ中加入0.1ml显色液，避光显色10～30min；

（N）最后用终止液终止反应；

（O）结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。