[发明专利]采用LAMP技术检测嗜吞噬细胞无浆体方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及采用环介导等温扩增技术（LAMP）检测嗜吞噬细胞无浆体方法。

背景技术

嗜吞噬细胞无浆体是立克次氏体目(Rickettsiale)无浆体科(Anaplasmataceae)无浆体属(Anaplasma)的一种重要的人兽共患病原体。该病原体广泛寄生于包括人、野生动物和家畜和啮齿动物的粒细胞内。人粒细胞无浆体病(Human granulocytic anaplasmosis，HGA)就是由嗜吞噬细胞无浆体(A.phagocytophilum)侵染人末梢血中性粒细胞引起的(Lj Zhang,Y Liu,et al.Nosocomial Transmission of Human Granulocytic Anaplasmosis in China[J].The Journal of the American Medical Association,2008,300(19):2263-2270)。

目前，无浆体的主要检测方法有病原学诊断、血清学诊断法和分子生物学诊断法等。

病原学诊断主要有血涂片检查和动物接种试验。血涂片检查仍是无浆体检查最为经典的方法，其要求在疑患病动物用药之前体温较高时进行采血做血涂片，用姬姆萨染色法染色，染色后在1000倍油镜下观察结果。该方法虽简单可靠，但在实验过程中需要使用显微镜，对人员要求较高，且检出率低(党志胜,蒋锡仕,黄孝玢.我国牛羊边虫及边虫病的研究现状[J].青海畜牧兽医杂志，2003,33(4):39-41)。临床上，若被检动物染虫率很低，不能确诊，可通过人工培养病原，接种实验动物来人工感染动物，然后收集接种动物的血液，进行诊断(G Ulrike,Munderloh,M Cynthia,M Lynch,et al.Isolation of an Anaplasma sp.Organism from White-Tailed Deer by Tick Cell Culture[J].Journal of Clinical Microbiology,2003,41(9):4328-4335)。无浆体的体外培养往往需要较好的实验条件和操作熟练的专业技术人员，因此该方法不适用于田间流行病学调查，而较适合于病原的实验室分离。

血清学诊断主要有补体结合试验（CF）、酶联免疫吸附试验(ELISA)。在我国，张其才利用边缘边虫高染虫率的含虫血所制备的补反诊断抗原具有敏感性良好和特异性很强的特点，CF方法对试验条件下人工感染牛的补反检出率为99%，安全区无假阳性反应(张其才,吕文顺,窦惠芳,等.补体结合试验诊断边虫感染牛的研究[J].中国兽医科技.1993,23(5):8-10)。该方法虽然具有其自身的很多优点，但其自身仍存在不足，它要求抗原和抗体的比例适当，否则会出现假阳性或假阴性现象，另外，由于操作条件和技能等较高要求的限制而不适合于田间流行病学调查。2007年Glen等证实了ELISA方法能够有效且可靠的诊断家养羊的绵羊无浆体病和野生有蹄类动物的无浆体病(Glen A Scoles,WL Goff,TJ Lysyk,et al.Validation of an Anaplasma marginale cELISA for use in the diagnosis of A.ovis infections in domestic sheep and Anaplasma sp.in wild ungulates[J].Veterinary Microbiology,2008,130(1-2):184-190)。2010年徐平源等还对湖南地区边缘无浆体的MSP4基因进行了克隆及序列分析，这些都为重组抗原ELISA诊断方法的建立奠定了基础。ELISA多用于样品的批量筛检，且特异性强，但其缺点在于对时间和操作的要求非常严格，必须有专业人员完成，而且对于阳性的区别比较模糊，有时候需要反复做(徐平源,何德肆.湖南地区边缘无浆体的MSP4基因的克隆及序列分析[J].中国预防兽医学报,2010,32(10):815-817)。