[发明专利]一种发酵生产多粘菌素E的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵生产多粘菌素E的方法，属于微生物制剂领域。

背景技术

多粘菌素E是由多粘类芽胞杆菌(Bacillus polymgxa)产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肤类抗生素的总称。在已知的抗生素中，多粘菌素E对革兰氏阴性杆菌的杀菌作用最强。临床上常用其硫酸盐和钾硫酸盐用于治疗革兰阴性菌感染，也可用做饲料添加剂促进禽畜生长和提高饲料利用率。

目前，多粘菌素E的生产研究主要在诱变育种、种子培养等方面，CN101235406A公开了一种发酵法合成多粘菌素E的方法，其中所述发酵培养基使用的有机氮源的浓度为4-10%，最大发酵单位22143U/ml。《多粘菌素E发酵工艺研究》（赖滨霞，化学工程与装备，2010年11期，P20-21）研究了温度、溶氧、生物素、磷酸盐及PH对多粘菌素E发酵的影响，结果表明在控制培养温度34℃,溶氧40%以上的条件下,采用补料和自动控制PH工艺,可明显提高发酵效价,从480000u/ml提高到650000u/ml。

虽然，近年来对多粘菌素E的研究已经取得一定进展，但总体来说，多粘菌素E的发酵产量依然偏低。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种发酵生产多粘菌素E的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种发酵生产多粘菌素E的方法，包括以下步骤：

1）种子培养：将冷冻多粘芽胞杆菌孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基接种3ml冻存孢子液，接种量万分之一，控制温度33±0.5℃，通风量0.6-0.9vvm，转速350-450rpm，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧40-60%，培养30-40h,得到种子液；

2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按5-8%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，控制温度33±0.5℃，通风量0.5-0.8vvm，转速250-350rpm，全程氨水自控pH5.5-6.0，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧20-40%，培养培养75-85h，得到多粘菌素E。

在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。

在步骤2）中，所述发酵培养基的碳源浓度为5%-10%，氮源浓度为3%-8%，优选碳源浓度为6-7%，氮源浓度为3.5-4%。

所述碳源为葡萄糖、木薯淀粉、糖蜜、玉米淀粉中的一种或两种以上；所述氮源为大豆水解液、豆粕粉、玉米浆、毛发水解液、硫酸铵中的一种或两种以上。

在本发明技术方案中，所述发酵培养基还包括CaCO₃及微量元素。

其中，所述CaCO₃在发酵培养基中的浓度为0.1%-0.3%，优选0.2%。

所述微量元素为Mg^2﹢、K⁺和Na⁺，其中，Mg^2﹢、K⁺与Na⁺的质量比为4:3:5；微量元素总质量占发酵培养基体积的0.03%-0.08%（m/v），优选0.06%（m/v）。

本发明中所述多粘芽孢杆菌孢子液均为市售产品。

本发明通过对发酵培养基中碳源和氮源的配方进行优化，合理碳氮比搭配，利用非粮作物木薯淀粉代替部分粮食作物葡萄糖、玉米淀粉等，并且在现有发酵培养基配方基础上增加碳酸钙和微量元素，使多粘菌素E的产量显著提高，多粘菌素E的最大产量可达到710000u/ml。本发明生产多粘菌素E的方法，成本低，产率高，适合大规模企业推广。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种3ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.06MPa，全程控制溶氧45%，培养35h，得到种子液;

2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按5%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，控制溶氧30%，培养80h，结果得到650000u/ml的多粘菌素E。

其中在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。