[发明专利]五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是呼肠孤病毒的一个属，其基因组包含11个片段的双链RNA（dsRNA）病毒，目前已知轮状病毒可分为7个组(A～G)，其中A轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原体，全球每年约有45～65万5岁以下儿童死于轮状病毒性腹泻。VP7和VP4是A组轮状病毒外壳的两个蛋白，能刺激宿主机体刺激产生中和抗体，是病毒中和作用相关抗原，准确对其血清型和血清型进行鉴定对于A轮状病毒疫苗研究具有重要意义。根据VP7和VP4的不同，A组RV被分为21个G血清型和35个P血清型，其中至少11个G型和12个P型为人RV。目前，全球有5种RV主要流行株，即G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]。

RV初始感染主要引起同型特异抗体反应，再次感染可引起同型和异型交叉抗体反应。由于其特殊的节段性基因组结构，不同株RV在动物、人体内或体外组织培养中共感染时，可发生基因重配。此为发展多价重配疫苗的分子基础。

人-牛五价重配轮状病毒疫苗分别以编码人轮状病毒5个主要血清型G1、G2、G3、G4和G9作为VP7单基因替换的亲本毒株，其余10个基因都来自牛轮状病毒（UK株），由此构建了以牛轮状病毒为骨架的五价基因重配疫苗。这些单基因重配体被设计为D×UK（G1型）、DS1×UK（G2型）、P×UK（G2型）、ST3×UK（G4型）和AU32×UK（G9型），五个单基因重配体联合应用即为涵盖人轮状病毒主要G型（G1、G2、G3、G4和G9型）的五价基因重配减毒疫苗。

近年来通过多重聚合酶链反应（PCR）技术，即在同一反应体系中加入两种或两种以上引物，通过PCR扩增检测多种目的基因，其扩增的特异性和效率与单一PCR相当，但同时可扩增针对不同模板的多个靶序列，是一种简便、快速的方法，尤其适合于抗原分型检测。

发明内容

本发明的目的是提供五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对，所述引物对选自引物对1～5中的至少一种：

引物对1：以轮状病毒G1血清型VP7基因为靶基因的引物对

上游引物5′-CTGTAGCATTATTTGCTTTGAC-3′

下游引物5′-CATATCTAATTCAAGACTTTGG-3′；

引物对2：以轮状病毒G2血清型VP7基因为靶基因的引物对

上游引物5′-TAACAGCACCATTTGTAAGG-3′

下游引物5′-ACAAACTTTTACCGTGCAGTC-3′；

引物对3：以轮状病毒G3血清型VP7基因为靶基因的引物对

上游引物5′-AGTTATACTGTCACCACTCCTT-3′

下游引物5′-TTTCCAGTTGCAGTGTAGCG-3′；

引物对4：以轮状病毒G4血清型VP7基因为靶基因的引物对

上游引物5′-ACTTAGATTCGTTTCTGGTGAG-3′

下游引物5′-TGCCAGTTTTTCGCTATCA-3′；

引物对5：以轮状病毒G9血清型VP7基因为靶基因的引物对

上游引物5′-CTCCTTTTGCTTATCGTCATTG-3′

下游引物5′-TACCACTAAGTTTTCACTTGCG-3′。

优选地，本发明的用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的引物对为引物对1～5。

本发明还提供含有上述引物对的用于RT-PCR检测五价轮状病毒疫苗抗原血清型的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、RNA逆转录酶、RNase抑制剂、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供五价轮状病毒疫苗抗原血清型的检测方法，其是利用上述引物对或试剂盒对待测五价轮状病毒疫苗抗原血清型进行RT-PCR检测。

所述方法包括以下步骤：1）提取样品中的RNA；2）以步骤1）中提取的RNA为模板，进行RT-PCR扩增反应；3）分析扩增产物。

RT-PCR反应体系以50μL计为：