[发明专利]一种南江黄羊GSK-3β基因编码区全序列的克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，更具体地说涉及一种从南江黄羊肝脏组织中克隆GSK-3β（ Glycogen synthase kinase-3 beta）基因编码区全序列的方法。

背景技术

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一种通过自身磷酸化与去磷酸化起到调控作用，涉及多条通路，其中包括wnt、Hedgehog和IGF-1等重要信号通路的丝/苏氨酸蛋白激酶。其参与的通路可涉及细胞分化增殖调节，形态发育，诱导性神经退化疾病如阿尔茨海默病(AD)，糖原代谢病如二型糖尿病（Type II Diabetes），细胞有丝分裂，卫星细胞增殖分化，机体创伤修复，癌症发生等多个方面，在医学生物学等相关领域有重要的影响。GSK-3基因主要有两个亚型，即GSK-3α和GSK-3β。二种亚型在催化区域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。通过相关实验表明，两种亚型可功能型代偿，但依然有所差异：（1）GSK-3β在心肌细胞分化，心脏发育左右对称性，心脏摆位等过程中起主导作用；在超负荷压力下两种亚型磷酸化表现有所区别；（2）在胰岛素信号转导途径中, GSK-3β通过调节糖原合酶的活性来影响糖原的合成，两种亚型在肝糖原代谢中作用程度中有一定差异；（3）GSK-3两种亚型对细胞分化增殖及心血管发育影响有所不同；（4）在脑神经发育方面,GSK-3β的高表达与双向情感障碍(bipolar disorder)、阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease)等相关神经系统疾病关系更为密切；（5）GSK-3β在Wnt/β-catenin信号转导中起着重要作用，通过该通路对胚胎干细胞系发育的作用也有一定差异。目前，除了人与小鼠，GSK-3亚型在其他物种中的相关研究还非常有限。由此可见，在不同物种中深入探索GSK3-β相关特性会为相关病理学与生理学研究打下良好的基础。

RT-PCR克隆：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式反应以及分子克隆相结合的一种技术。首先利用反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增我们需要的目的基因片段，然后将此片段与载体连接转化到感受态细胞中进行克隆，获得的质粒PCR产物进行测序。此技术利用PCR 技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，能够快速获得其它依靠限制性内切酶消化法难于得到的PCR产物；同时该方法能克服普通PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cDNA末端快速扩增) 技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本较低，工作量小。该技术的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计正向引物，在终止密码子的下游设计反向引物，使得PCR产物能包含完整的基因编码区全序列。

获得目的基因编码区序列一般采用克隆或RACE技术，RACE技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端。但该技术与克隆技术相比，目的基因片段的长度不明确，试验成本高，工作量大，对于提取的RNA质量要求较高，因此应用相对较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速获取南江黄羊GSK-3β基因完整编码区序列的方法，填补在南江黄羊上该基因研究的空白，为进一步研究其在南江黄羊上的功能奠定基础。

本发明采用以下技术方案：

一种克隆南江黄羊GSK-3β基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：

A1、从南江黄羊肝脏组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；

A2：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；

A3：以cDNA为模板进行PCR扩增；

A4：扩增产物的胶回收和纯化；

A5：纯化的产物进行克隆与测序，即能得到南江黄羊GSK-3β基因的编码区全序列。