[发明专利]一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方

说明书

技术领域

本发明涉及酶法分析测定尿酸含量双试剂法试剂盒的配方，及其在体液尿酸含量测定中的应用方式。

发明的技术背景

测定尿酸可用于实验诊断痛风和肾脏疾病。测定血清尿酸主要用尿酸酶偶联过氧化物酶反应测定显色产物吸收。此方法需用尿酸酶催化尿酸完全氧化成尿囊素、过氧化氢和二氧化碳；过氧化物酶催化过氧化氢氧化生色底物形成显色产物；测定显色产物吸收，推定过氧化氢量以确定尿酸量。4-氨基安替比林是过氧化物酶偶联测定常用的生色底物；常用尿酸酶来自真菌或细菌；过氧化物酶常来自辣根。此法需定量测定过氧化氢；样品中抗坏血酸等还原剂对测定造成负干扰；用抗坏血酸氧化酶先清除样品中抗坏血酸并测定吸收，再加入尿酸酶反应测定吸收；以两步吸收之差校正体积因素后定量尿酸，可基本消除抗坏血酸的干扰。应用此类方法的试剂盒需用两种试剂溶液，一种试剂为1，其含缓冲液、过氧化物酶的辅助生色底物及除了尿酸酶以外的其余酶，包括过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶；另一种试剂为2，含尿酸酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和缓冲液；故此类试剂盒配制方法称双试剂法。配制时，试剂1和试剂2的pH允许在一定范围内变化以尽可能保障所用酶的稳定性，但试剂1和试剂2在最终反应体系的混合体积比例取决于各自的pH，以使得最终反应pH处于7.2～7.5之间而获得稳定的显色产物，而试剂1和试剂2中的各种酶的浓度则需要据上述混合比例调整以使得最终反应体系中各种酶的活性保持一致；最终反应体系中加入样品体积占总体积的1～3％。

尿酸酶的最稳定pH偏碱性且催化活性的最适pH也偏碱，但辣根过氧化物酶等最稳定pH接近7.0且催化活性的最适pH在中性，抗坏血酸氧化酶最稳定pH接近6.5而催化活性的最适pH接近中性。双试剂法测定尿酸含量时，当两种试剂混合后的pH在7.2～7.5之间时显色产物最稳定且吸收测量灵敏度最高。此类双试剂法测定尿酸含量试剂盒所需的酶是其成本的决定因素；这些所需酶中，尿酸酶的比活性最低而其用量需要足以将尿酸完全氧化，但现有商品化尿酸酶室温下的最大比活性低于商品化辣根过氧化物酶最大比活性的10％，更低于商品化抗坏血酸氧化酶最大比活性的2％，故此类试剂盒的主要成本在于尿酸酶。双试剂法测定尿酸含量试剂盒的经典配方中，试剂1和试剂2的缓冲液都为相同pH；这样最终混合反应体系的pH就取决于所用试剂1和2的pH。鉴于尿酸酶在碱性条件下稳定性更好且活性更高，常选用pH8.0～8.3作为试剂1和试剂2的共同pH，但这种最终pH下反应显色产物不稳定，使得测定精度受到操作重复性的严重影响，即使用于自动分析，在线样品的数量也影响测量结果。如改用显色产物最稳定的中性pH，为了保障双试剂法试剂盒的货架寿命，生产时试剂2中尿酸酶必须用尽可能高的初始浓度，这造成试剂盒的配制成本较高。

如将双试剂法测定尿酸的试剂盒中，试剂1配制成中性或略偏酸溶液以保证辣根过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶的稳定性；将试剂2配制成碱性即其pH>8.0以提高尿酸酶的稳定性，从而可降低试剂2中尿酸酶初始浓度，使得试剂盒所消耗的酶量降低或者显著延长试剂盒的货架寿命；通过调整试剂1和试剂2的比例，仍能使最终反应混合物的pH在7.2～7.5之间，以保障检测可靠性和灵敏度。经过探索，发现用pH约6.5的磷酸盐缓冲液配制试剂1，用pH约9.2的硼砂缓冲液配制试剂2，最后反应混合物中试剂1和试剂2的体积比例约为3.2：1～4.7：1，试剂2就能用尽可能低的初始尿酸酶浓度获得相同的试剂盒货架寿命，同时使得最终反应混合物的pH达到使得显色产物稳定性最好和检测灵敏度最高的要求。

发明内容概述

本发明所要解决的技术问题是提供一种双试剂法测定血清尿酸试剂盒的新配方，克服迄今为止采用的尿酸测定双试剂法试剂盒要么尿酸酶用量大，要么货架寿命短的缺点。本发明的配方能明显提高尿酸酶在试剂2中的稳定性，降低其初始浓度而降低成本，而试剂盒中其他酶的稳定性也有提高，总体可达到较长的货架寿命而成本更低。所制得的试剂盒可用于测定血清尿酸水平。

本发明所述的双试剂法测定尿酸的试剂盒优选两种试剂的配方如下。试剂1：辣根过氧化物酶1.5U／ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗坏血酸氧化酶0.67U／ml，防腐剂苯甲酸钠3.5mM，50mM磷酸盐缓冲液pH为6.5～7.0。试剂2：尿酸酶2.0U／ml，N-乙基N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(Toos)2.33mM，防腐剂苯甲酸钠3.5mM，50mM四硼酸钠缓冲液pH为8.0～9.6。