[发明专利]冠状病毒NL63实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种冠状病毒NL63实时荧光PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

背景技术

冠状病毒容易发生突变，产生新的变异株。只有积极开展病原学监测，充分了解病毒来源、传播途径、特性、所引发的疾病以及相应的检测和治疗等方面进行研究，才能避免像SARS那样的灾难。快速而敏感的检测方法的建立，对于冠状病毒NL63（HCoV-NL63）以及目前尚未发现的冠状病毒变异株的检测有重要的意义。分子生物学技术为WHO（世界卫生组织）推荐的病原检测手段，其可在短时间内确认病原、大幅节约检测时间和成本，敏感度和特异性也超越现有各类实验室检测手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种冠状病毒NL63实时荧光PCR非诊断性检测方法，该方法能够对病毒快速、灵敏、高效的检测，本发明的另一目的是提供一种实施上述方法的冠状病毒NL63实时荧光PCR检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明冠状病毒NL63实时荧光PCR非诊断性检测方法，其设计的引物和探针为：

进一步，所述非诊断性检测方法的具体步骤为：

1）设计所述引物和探针；

2）提取病毒RNA；

3）实时荧光PCR扩增及分析：通过调整反应体系中探针和引物的反应浓度，选择最佳反应体系。

进一步，所述反应体系为：2X One Step RT-PCR Buffer312.5μl，TaKaRa Ex Taq HS0.5μl，PrmieScrip RT Enzyme Mix20.5μl，Primer10.2μl，Primer20.2μl，Probe1μl，ROX Dye II0.5μl，Rnase Free dH2O4.6μl。

进一步，所述反应体系的反应条件为：42℃8min；95℃10s；95℃5s，58℃34s，45Cycles。

进一步，所述非诊断性检测方法对冠状病毒NL63的最低检测量为7.49×10¹copies/ml。

一种实施上述方法的冠状病毒NL63实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒中采用的引物和探针为：

本发明非诊断性检测方法和试剂盒对HCoV-NL63实时荧光PCR方法特异性好、敏感性高、稳定性，在临床鉴别诊断、口岸物品所携带冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实时PCR最低检测限反应曲线图；

图2为实时PCR重复性反应曲线图；

图3为实时荧光PCR方法重复4次检测稀释至10^-8病毒质粒度样品的反应曲线图。

图4为正常咽拭子样本实时荧光PCR方法检测结果图。

具体实施方式

下面，参考附图，对本发明进行更全面的说明，附图中示出了本发明的示例性实施例。然而，本发明可以体现为多种不同形式，并不应理解为局限于这里叙述的示例性实施例。而是，提供这些实施例，从而使本发明全面和完整，并将本发明的范围完全地传达给本领域的普通技术人员。

本发明冠状病毒NL63实时荧光PCR非诊断性检测方法，所涉及的材料包括：

HCoV-NL63质粒：根据提供的DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段。DNA合成由大连宝生物有限公司完成。将合成的HCoV-NL63DNA连接、转化至E.coli Competent Cell JM109载体上，构建质粒，用于实时荧光PCR的模板。病毒基因的合成和质粒的构建由大连宝生物有限公司完成。

阳性标本：甲型流感病毒、2009甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒阳性咽拭子标本均为本实验室测序确证样本、H5N1和H9N2核酸为北京疾病预防控制中心和中国军事医学科学院提供。肠道病毒CA16和EV71标本为四川国际旅行卫生保健中心提供。

阴性标本：采集的94份正常咽拭子来自深圳口岸医院正常群。

实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司ABI7500型。核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司Viral RNA Mini Kit。Real-time PCR试剂盒为日本Takara公司产品。引物和探针由上海生工有限公司合成。

本发明冠状病毒NL63实时荧光PCR非诊断性检测方法，所涉及的引物和探针的设计：