[发明专利]角蛋白酶的酶活检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物酶领域，尤其涉及一种新型的角蛋白酶的酶活检测方法。 

背景技术                                                                 

角蛋白酶（keratinase）是一种可专一地降解角蛋白的蛋白酶类，也是一种诱导酶，只有当环境中出现诱导子（角蛋白）时才会合成。目前已发现30余种微生物可分泌角蛋白酶，这些微生物主要来自于真菌、放线菌和细菌，如真菌中的皮肤癣菌（Dermatophytes）和白色假丝酵母（Candida albicans），放线菌中的链霉菌（Streptomyces），细菌中的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等等。

早在19世纪初人们就发现一些生物能降解角蛋白，自那时以来分离此类菌株的工作一直在进行。目前发现可降解角蛋白的微生物已有30多种，其中有细菌、放线菌和真菌。细菌中主要是地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），放线菌中主要是高温单胞菌属（Thermmonospora），真菌中主要是白色假丝酵母和链霉菌（Streptomyces）。不同微生物产生的角蛋白酶具有一定的差异，主要表现在酶的存在方式以及酶的结构、组成、稳定性、最适反应温度、pH值等方面。例如角蛋白酶的存在形式，有的主要存在于胞内，有的主要分泌至胞外，而霉菌的角蛋白酶既可见于胞内又可分泌至胞外。 

角蛋白酶可由多种微生物产生，能特异性地降解角蛋白，在饲料、皮革、医药业、食品等工业及环境治理方面具有广阔的应用前景。 

微生物中纯化的角蛋白酶活性很强，可以水解多种难降解的纤维蛋白类，如胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白。因此角蛋白酶具有广泛的应用前景。 

1、 在农业上，微生物产生的角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，可以用于制造有机肥料，这种有机肥料不仅解决了国内能源紧缺的难题，还降解了污染源，大大改善了环境。在这方面，对于农业资源和畜牧业资源紧缺的中国来说，无疑是一个巨大的资源宝库。 

2、 在饲料产业中，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋白成分在80%以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源。我国平均每年产羽毛达数10万吨，绝大部分未得到合理利用。因此，对废弃羽毛的开发、利用具有重要的应用前景，它一方面解决了当前饲料工业中蛋白资源不足的问题，另一方面又可解决环境污染问题。 

3、 角蛋白酶还可用于化妆品、工业生产及医药方面。在当今生物处理日益受到关注的形势下，开发有发展潜力的角蛋白降解酶以实现角蛋白的高效生物降解已成为大势所趋。角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，因此，能否利用角蛋白酶抑制剂或者角蛋白酶单克隆抗体抑制角蛋白酶的作用，削弱皮肤真菌的侵袭性，从而达到治疗皮肤真菌感染的目的，是今后研究角蛋白酶与皮肤真菌感染相互关系的一个重要方向。角蛋白酶具有高效的角蛋白水解活性，利用角蛋白酶改善药物在角蛋白中的通透性，可提高皮肤外用药物的疗效。特别是在银屑病、角化过度性皮肤病( 神经性皮炎、慢性湿疹等) 的治疗应用方面非常值得研究。 

角蛋白酶也可应用于美容护肤品，帮助活性因子透过皮肤屏障，去除皮肤多余角质，实现皮肤的深层护理。角蛋白酶能水解毛发角蛋白，利用角蛋白酶进行脱毛，治疗多毛症也可能具有良好的应用前景。 

角蛋白不溶性于水及大部分有机溶剂，使得角蛋白酶活性测定比一般蛋白酶困难。常用测定角蛋白酶的原理是以底物水解后释放的氨基酸的量来确定角蛋白酶的活性。 

关于角蛋白酶的检测，目前多采用碱性蛋白酶的通用方法（酪蛋白为底物），但角蛋白酶虽然在分类上属于碱性蛋白酶的范畴，但它特异作用于角蛋白，采用上述方法检测的专属性不强，因此开发以角蛋白为底物的检测方法更能准确反映出酶活力的高低。 

测定角蛋白酶的酶活，一种方法是直接以角蛋白粉作为底物进行测定，涂国全等曾以羽毛粉作为测定角蛋白酶的底物，进行测定；另外一种方法是以可溶性的羽毛角蛋白作为底物表征角蛋白酶的活性，该方法由Wawrzkiewicz提出，它是利用二甲基亚砜溶解羽毛角蛋白，再用异丙醇经行沉淀，干燥后的可溶性角蛋白溶解于相应的缓冲液中作为底物。但上述方法经过验证都存在重复性差，测定偏差较大的问题。