[发明专利]一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于包括-28位点引物对、CDs41/42和CDs71/72位点引物对、CD17位点引物对和IVS-Ⅱ-654位点引物对：

-28位点引物对：

上游引物为：5’-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3’；

下游引物为：5’-ACTTCTCCTCAGGAGTCAGGT-3’；

CDs41/42和CDs71/72位点引物对：

上游引物为：5’-GAAGACTCTTGGGTTTCTGA-3’；

下游引物为：5’-AGAAAACATCAAGGGTCCCA-3’；

CD17位点引物对：

上游引物为：5’-AGACACCATGGTGCACCTGAC-3’；

下游引物为：5’-GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3’；

IVS-Ⅱ-654位点引物对：

上游引物为：5’-GTGTACACATATTGACCAAATCAGGGTA-3’；

下游引物为：5’-GGTAGCTGGATTGTAGCTGC-3’。

2.根据权利要求1所述的快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒将-28位点引物对及CDs41/42和CDs71/72位点引物对按1:1的比例在放置在一起，CD17位点引物对、IVS-Ⅱ-654位点引物对分别放置。

3.根据权利要求1所述的快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含Taq DNA聚合酶、dNTP、染料、MgCl₂、PCR缓冲液、水和对照模板；

所述的染料为SYBR Green I；

所述的水为双蒸水或超纯水；

所述的对照模板包括正常样本和已知阳性对照突变位点样本。

4.根据权利要求3所述的快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于：所述的正常样本为经测序证实的无β-珠蛋白基因突变的人DNA模板样本；

所述的已知阳性对照突变位点样本为-28、CD17、CDs41/42、CDs71/72、IVS-Ⅱ-654位点突变的纯合子及杂合子的人的阳性DNA模板。

5.根据权利要求1所述的快速检测五种β-地中海贫血突变的试剂盒，其特征在于：含有-28位点引物对、CDs41/42和CDs71/72位点引物对、CD17位点引物对、IVS-Ⅱ-654位点引物对、2倍浓度的Master Mix、MgCl₂、水和对照模板；

所述的2倍浓度的Master Mix为罗氏制药有限公司生产的LightCycler480High Resolution Melting Master中的浓度为2×conc.的Master Mix，其中含有Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP和染料。

6.一种应用上述试剂盒进行快速检测五种β-地中海贫血突变的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；

（2）配制反应体系，具体如下：取3个PCR反应管，PCR反应管1中加入-28位点的引物对及CDs41/42和CDs71/72位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl₂和水；PCR反应管2中加入CD17位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl₂和水；PCR反应管3中加入IVS-Ⅱ-654位点的引物对、DNA模板、2倍浓度的Master Mix、MgCl₂和水；

（3）分别用步骤（2）配制的反应体系进行PCR扩增，分别得到相应的PCR产物，同时扩增含有对照模板的反应体系；

（4）将步骤（3）得到的PCR产物使用LightCycler480进行高分辨率熔解曲线分析；

（5）结果判断:以无β-珠蛋白基因突变的正常样本曲线作为基线，得到对应的熔解曲线图，与阳性对照突变位点熔解曲线图进行比对从而确定是否存在突变，熔解曲线形状与已知阳性对照突变位点熔解曲线图不一致的，需重新检测或者测序明确基因型。