[发明专利]间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白、其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种用于检测间日疟感染病人血清抗体的间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白；此外，本发明还涉及上述重组抗原蛋白的制备方法和用途。

背景技术

疟疾是严重危害人类健康、影响社会经济发展的重要寄生虫病。全球每年有约100万人死于疟原虫感染。疟疾（间日疟为主）也是我国重要传染病之一，尽管目前疟疾发病率已控制在较低水平，但是在全球气候变暖、经济发展全球化带来的人流物流增加等自然和社会因素的影响下，我国疟疾疫情尚不稳定。例如中国云南与缅甸边境地区，以及安徽、河南等一些中部地区，每年报告总病例数均超过数千例。随着国际交往日益频繁，我国的输入性疟疾病例逐年增加，据统计我国2010年输入性疟疾病例1161例，比2009年上升29.4%；由于传播媒介疟蚊仍然存在，本地发病病例时有发生，因而疟疾形势仍然十分严峻。加上人们生活方式的改变和活动范围的扩大使间日疟的监测和防控工作具有极大的难度。因此，敏感、特异的诊断试剂研发已成为当前国内外间日疟研发的重点与热点。

长期以来，在间日疟流行区，各类诊断方法仍不尽如意，或是诊断敏感性不够、或是因特殊设备基层难以使用。以免疫学中抗原-抗体的特异性反应为基础的免疫检测技术一直是疟疾检测的有效方法。以检测疟原虫抗原为靶标的试纸条法（Rapid diagnostic test，RDT）一直被广泛应用于疟疾流行区的病原诊断。但是，目前国内大部分流行区疟疾均处于消除阶段，疟原虫感染率与感染度都非常低，即处于RDT的检测域值范围外，往往会导致漏检。以检测疟原虫抗体为靶标的免疫检测技术，尽管无法区别现症或既往感染，但是由于其检测敏感性很高，可以作为疟疾消除或消除后阶段进行血清流行病学监测的有效工具。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原，该重组抗原可用于检测间日疟感染病人的血清抗体。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于间日疟原虫PvMSP1基因PCR扩增的特异性引物。

本发明要解决的技术问题之三是提供该间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述间日疟重组抗原蛋白在制备间日疟诊断试剂盒中的应用。

本发明首先通过生物信息学技术和分子生物学技术分析并获得了间日疟原虫PvMSP1的编码基因序列（如SEQ ID NO：2所示）。然后通过对间日疟原虫PvMSP1基因进行扩增，将所得产物与质粒载体pET-28a(+)通过In-Fusion克隆构建重组质粒pET-28a(+)-PvMSP1，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行PCR和测序鉴定；小量抽提测序成功的pET-28a(+)-PvMSP1重组质粒，将其转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中表达；取表达量较高的克隆，发酵制备菌体，破碎所得菌体；本发明采用10%SDS溶解蛋白包涵体，由于构建的重组蛋白含6个His，可选用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白，最终得到纯化的重组蛋白PvMSP1，完成了PvMSP1基因的体外克隆表达及纯化。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

本发明第一个方面是提供一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白，其具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。该重组抗原蛋白具有糖基化磷脂酰肌醇（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定及表皮生长因子样（epidermal growth factor-like，EGF-like）结构域，分子量为M_r42000。

本发明第二个方面是提供了一对用于间日疟原虫PvMSP1基因PCR扩增的特异性引物，其序列为：

上游：5′-AATGGGTCGCGGATCCgaccaagtaacaacgggagag-3′（如SEQ ID NO：3所示）；

下游：5′-GGTGGTGGTGCTCGAGgctacagaaaactccctcaaagag-3′（如SEQ ID NO：4所示）。

本发明第三个方面提供了一种间日疟原虫PvMSP1重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1）间日疟原虫PvMSP1基因序列的扩增，PvMSP1基因扩增的具体序列如SEQ ID NO:2所示（用PCR技术从含有目的基因的间日疟原虫基因组DNA中获得间日疟原虫PvMSP1的DNA片段）；