[发明专利]一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种病原微生物的检测方法及其专用引物，具体来说就是一种采用巢式PCR检测脊柱结核分枝杆菌的方法及其专用引物。 

背景技术

据世界卫生组织统计,全世界现有结核病人2000万,每年新发生约800万例,全世界平均每15秒就有一人死于结核病，每天有5000人因此丧生，仅2006年，就有200万人死于该病,约1/3人群有潜伏性结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）感染。在发展中国家，由于耐药结核菌株的出现，人口剧增、移民增加、旅游业发展、酗酒与贫困、吸毒、合并获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染、以及治疗性免疫抑制症导致的传染性结核病发病率逐年上升，从而使结核病控制趋势更加严峻。结核是成年人最主要的传染病杀手，也是HIV携带人群死亡的最主要感染原因。全球每年在结核方面的经济支出至少在120亿美元以上。 

骨关节结核是最常见的继发肺外结核，约占肺外结核发病率的10％，脊柱结核俗称脊柱痨、龟背痰，在骨结核中最为常见，发病率约为50％，而45％脊柱结核病人常常因为椎体逐渐破坏、塌陷，后凸畸形进行性加重，最后导致脊髓或神经根损害，严重者发生迟发性麻痹，甚至截瘫。 

因此对结核病的检测变得尤为重要，目前对脊柱结核的临床诊断主要依靠临床症状、实验室及影像学检查。影像学检查包括X片、CT和MRI等，特别是重建CT的应用，可获得椎体隐匿病变的立体印象；平片在脊柱结核的诊断是首选的，但是其敏感性不高，在许多脊柱结核患者，临床症状很明显时，X平片可无表现，而在平片中被发现时，椎体50％的骨矿已丢失，MRI作为较好的诊断技术之一，但做为普查及初筛时的检查，因其价格高而不能广泛使用。许多脊柱结核的临床症状和影像学表现多在疾病的中晚期出现，有的甚至不典型，故其诊断的及时性有限。结核的实验室检查包括涂片，菌培养及免疫学检查。结核病的细菌学检查，是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，但由于MTB的生长缓慢，脊柱结核患者排菌量少,致使作为“金标准”的结核细菌学培养存在着灵敏度低，操作复杂，需时较长，影响因素多，不易标准化等缺点；另外，由于脊柱、脊髓的解剖特性，脊柱结核起病隐匿，对脊柱结核，病灶取材多为有创检查，且椎体或深部脓肿的穿刺需要一定的技术要求，从而限制了其广泛应用；免疫学中的纯化蛋白衍生物(PPD)试验阳性率低，特异性差。因此，一种快速、灵敏、准确的早期脊柱结核诊断方法显得十分重要的意义。 

自1985年美国PE Cetus公司的Kary Mullis建立聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术以来，PCR技术因其灵敏、特异、快速,已被广泛应用于遗传诊断、基因研究及病原体的检测等各方面，极大推动了生命科学的研究进展。而PCR自1989年引入结核病的检测以来,该技术对于难以培养、生长缓慢的结核分枝杆菌的分子生物学研究有着独特的意义，近年来，以PCR为基础的新型基因诊断技术发展很快，目前，不少学者正在探索如将特异性强的DNA探针与敏感性高的PCR技术相结合，并已成功用于临床标本结核分枝杆菌的检测。PCR技术目前在检测肺结核患者的痰液及其外周血中结核分枝菌DNA含量方面已较成熟，在脊柱结核患者脓液中检测结核分枝杆菌DNA含量方面也有很多研究，但用巢式PCR探讨快速检测结核分枝杆菌DNA及其含量的研究及临床应用，国内外文献报道较少。 

发明内容

本发明的目的是提供一种采用巢式聚合酶链式反应（简称巢式PCR）来检测结核分枝杆菌DNA的方法及其专用引物。 

其中两对引物为以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为上游引物，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4为下游引物；所述引物对组的核苷酸序列分别为： 

上游引物A:TB(5,-GGCGGGACAACGCCAATTGCG-3,)

上游引物B:TB(5,-ACGACCACATCAACC-3,)

下游引物C:TB(5,-AGTTTGGTGTCATCAGCC-3,)

下游引物D:TB(5,-CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG-3,)。

    上述引物的含量分别为： 

上游引物A: 290bp(SEQ ID No.1)

上游引物B: 856bp(SEQ ID No.2)

下游引物C: 505bp(SEQ ID No.3)

下游引物D: 670bp(SEQ ID No.4)。