[发明专利]一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速制备瑞香狼毒中6种化合物的新工艺。主要包括正、反相柱层析分离富集以及快速的高效液相色谱除杂制备。化合物1（异西瑞香素）为双香豆素，化合物2（雁皮素B）、3（雁皮素C）、4（(+)-狼毒宁B）、5（异狼毒宁B）、6（异狼毒宁A）为双二氢黄酮。其中，化合物1为狼毒属植物中首次制备，化合物2、6为该类双二氢黄酮的新异构体。这6种化合物的化学结构分别如下：

背景技术

瑞香狼毒（Stellerachamaejasme L.）系瑞香科狼毒属植物，俗名断肠草，分布于中、俄、蒙、朝等国，在我国主要产自北方各省区及西南地区，生于海拔2600～4200米干燥而向阳的高山草坡、草坪或河滩台地。其味苦辛，性平，有大毒，入肺脾肝经，根入药，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有很好的抗肿瘤活性，最新研究还发现其具有抗病毒、抗菌、抗惊厥和免疫调节等作用。目前，从瑞香狼毒中分离鉴定出的化学成分主要有二萜类、倍半萜类、黄酮类、香豆素类、木脂素和苯丙素苷类等，其中，黄酮类多为双二氢黄酮，是该药材的指标性化学成分，也是其主要活性成分之一。雁皮素C（化合物3）对恶性疟原虫氯喹耐药性株具有明显的杀除作用，其IC₅₀值可达0.56μg/ml（Nunome S,et al.PLANTA MED,2004,70(1)）；（+）-狼毒宁B（化合物4）在体外能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，对人肺腺癌细胞A549的IC₅₀值可达1.08μmol/L（Zhang C，et al.ACTA PHARMACOL SIN，2013，34（2））；异狼毒宁B（化合物5）显示较强的抗真菌和抗有丝分裂活性，对稻瘟霉的MIC值为6.25μg/mL（Yang G，et al.CHEM PHARM BULL，2005，53（7））；对化合物2、6的分离制备和药理研究还未见报道。另外，作为质控指标成分，必须有大量可用的化学对照品供应，但目前市场上对包括这6种化合物在内的香豆素和双二氢黄酮类对照品鲜有提供。因此，对瑞香狼毒药材中这6种化合物同时、高效制备方法的研究具有重要意义。

发明内容

本发明在前期研究瑞香狼毒化学成分系统分离分析的基础上，提供了一种快速制备瑞香狼毒药材中6种化合物（异西瑞香素、雁皮素B、雁皮素C、(+)-狼毒宁B、异狼毒宁B和异狼毒宁A）的新工艺。以瑞香狼毒药材为原料，经正相硅胶柱层析、反相ODS柱层析初步分离富集，以制备型高效液相色谱为最终分离手段，通过一步高效液相制备，收集含各化合物的流份直接减压浓缩至干即可获得纯度大于98%的化合物。具体步骤如下：

（1）正相硅胶柱层析：

取瑞香狼毒药材95%乙醇提取浸膏，以氯仿、甲醇中的一种或两种的混合液溶解，在不断搅拌下，加入与浸膏等质量的200～300目柱层析硅胶，拌样，常温下充分晾干；之后干法上样，常压下过200～300目硅胶柱，依次以氯仿、氯仿-甲醇100：1、氯仿-甲醇50：1、氯仿-甲醇20：1洗脱，收集氯仿-甲醇20：1流份，负压浓缩回收溶剂后，得一级粗分物。

（2）反相ODS柱层析：

将上述一级粗分物以甲醇溶解后，加入与一级粗分物等质量的粒径为40～50μm ODS柱层析填料拌样，常温下充分晾干并处理成粉状；之后干法上样，过40～50μm ODS层析柱（柱长40cm，内径8cm），中压泵加压，压力为5～10MPa，流量控制在50～100ml/min，依次以15%、30%、45%、60%、70%甲醇-水洗脱，收集70%甲醇-水流份，负压浓缩回收溶剂后，得二级粗分物。

（3）高效液相色谱制备：

将上述二级粗分物以DMSO溶解，配制成浓度为50～100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤；滤液采用柱长25-50cm、直径2-10cm的高效液相制备色谱柱进行分离，每次进样体积为0.5～2.5ml，以体积浓度70%～80%甲醇-水或45%～55%乙腈-水溶液为洗脱体系，流速控制在10～100ml/min，在线紫外检测，检测波长设定为295nm，分别收集含有化合物1、2、3、4、5、6的流份，负压干燥得6种粉末，即为纯度大于98%的化合物1、2、3、4、5、6纯品。

上述方法中，高效液相制备柱的填料为C₁₈键合相，其粒径为5～10μm，紫外检测波长优选295nm，具体检测波长根据样品中目标化合物信号的超载情况而定。