[发明专利]四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法。 

背景技术

泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)在分类学中属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus)，是亚洲特有的野生小型淡水鱼类，广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本。我国各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水沟、稻田等均有分布。泥鳅肉质细嫩、味美，营养丰富，有“水中人参”之称，除了较高的食用价值，它还具有定的滋补药用功效，是市场上畅销的特种水产品之一。除了具有重要经济价值外，泥鳅还是一种很好的细胞学、遗传学等方面的研究材料。 

泥鳅存在多倍体现象，天然四倍体约占2％。关于四倍体泥鳅的研究主要涉及和二倍体杂交生产三倍体，迄今为止还没有关于体外培养四倍体泥鳅鳍细胞的相关报道。 

大量的研究报道证实四倍体和肿瘤的发生有关。四倍体泥鳅细胞系的建立不仅用于种质资源保护、四倍体特性的机理分析，而且以其为模型进行肿瘤的研究也是非常有益的。 

发明内容

鉴于上述问题，本发明的目的在于提供一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法。 

所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF于2013年8月19日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No：C2013111。 

所述细胞系支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。 

本发明还提供一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的建立方法，包括 以下步骤： 

I、制备细胞培养液 

所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成所述培养液，胎牛血清占培养液总体积的20％，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10μg/ml，所述培养液存放在4℃； 

II、原代培养 

在无菌环境下剪取四倍体泥鳅的鳍组织，先用质10wt％的碘伏浸泡剪下的所述鳍组织15分钟，再用含有终浓度为500IU/mL的青霉素和终浓度的500μg/mL链霉素的混合液浸泡30分钟，然后用无菌PBS漂洗，将漂洗后的鳍组织剪成1mm³左右的小块，均匀接种在没有培养液的细胞培养瓶中，在25℃的CO₂培养箱中正置干贴24小时，然后往所述培养瓶中加入所述培养液，放置在25℃的CO₂培养箱中继续培养； 

III、传代培养 

待步骤II的细胞长成单层后，移走所述培养瓶中的培养液，然后往所述培养瓶中加入0.25％的胰蛋白酶溶液对所述细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一层胰蛋白酶膜继续消化1分钟，然后加入培养液吹打消化后的细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液按预定比例转入新的培养瓶中，并补加培养液，在25℃的CO₂培养箱中培养； 

IV、按照步骤III的过程传代，30代后所用培养液为含20vo1％胎牛血清的DMEM/F12培养基。 

本发明所提供的四倍体泥鳅鳍细胞系可用于进行病毒学、病理学、毒理学、免疫学、遗传育种和种质保存等理论研究以及病毒疫苗研制等应用研究。 

附图说明

图1是在显微镜下观察，本发明的四倍体泥鳅鳍细胞系的形态图。 

图2是示出图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分析图。 

图3是对图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系进行SSR分析的结果图。 

图4是示出图1所示四倍体泥鳅鳍细胞系生长曲线的图。 

图5是示出接种鲤春病毒血症病毒两天后的四倍体泥鳅鳍细胞系形态的图。 

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的四倍体泥鳅鳍细胞系及其建立方法进行说明。 

1、细胞系的建立 

四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF通过下述步骤建立。 

(1)制备细胞培养液