[发明专利]四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF及其建立方法

权利要求书

1.一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF，于2013年8月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：C2013111。 

2.根据权利要求1所述四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF，其特征在于，所述细胞系支持鲤春病毒血症病毒的生长和复制。 

3.一种四倍体泥鳅鳍细胞系TEMF的建立方法，包括以下步骤： 

I、制备细胞培养液 

所用培养基为市售的DMEM/F12培养基，加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子和硫酸软骨素，配制成所述培养液，胎牛血清占所述培养液总体积的20％，人碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子的终浓度为20ng/ml，硫酸软骨素的终浓度为10μg/ml，所述培养液存放在4℃； 

II、原代培养 

在无菌环境下剪取四倍体泥鳅的鳍组织，先用10wt％的碘伏浸泡剪下的所述鳍组织15分钟，再用含有终浓度为500IU/mL的青霉素和终浓度为500μg/mL的链霉素的混合液浸泡30分钟，然后用无菌PBS漂洗，将漂洗后的鳍组织剪成1mm³左右的小块，均匀接种在没有培养液的细胞培养瓶中，在25℃的CO₂培养箱中正置干贴24小时，然后往所述培养瓶中加入所述培养液，放置在25℃的CO₂培养箱中继续培养； 

III、传代培养 

待步骤II的细胞长成单层后，移走所述培养瓶中的培养液，然后往所述培养瓶中加入0.25％的胰蛋白酶溶液对所述细胞进行消化处理，30秒后吸去胰蛋白酶溶液，利用在瓶底形成一层胰蛋白酶膜继续消化1分钟，然后加入培养液吹打消化后的细胞，制成细胞悬液，将细胞悬液按预定比例转入新的培养瓶中，并补加培养液，放在25℃的CO₂培养箱中培养； 

IV、按照步骤III的过程传代，30代后所用培养液为含20vol％胎牛血清的DMEM/F12培养基。