[发明专利]基于实时荧光PCR的尿沉渣细胞肾脏纤维化检测芯片

说明书

技术领域

本发明属于慢性肾脏疾病肾脏纤维化尿液生物标志物研究方法的建立，特别涉及一种基于实时荧光定量PCR芯片方法的尿液特异性信使核糖核酸(mRNA)检测技术的构建。

背景技术

实时荧光PCR技术是一种DNA（或RNA）扩增技术，其灵敏度高、专一性强，结合高分辨率熔解曲线分析或荧光探针，可以大大减少错配率，避免假阳性，是基因定量的金标准。在临床应用中，不同于传统方法检测基因的蛋白产物，实时荧光PCR技术直接检测基因的表达水平，广泛应用于临床研究：包括病原体基因检测、癌症基因检测、遗传病基因检测等，对于临床分期、判断预后以及治疗方案的选择具有重要意义。PCR靶向基因芯片通常根据研究要求选取与某一主题相关的靶分子，能够实现更有效、特异的生物标志物筛查，对基因表达的定量更为准确，是目前研究特定基因表达的理想方法。肾脏是机体重要的滤过和排泄器官，肾脏病变可以反映在其排泄物成份的变化中，尿液中蕴藏着大量生物学信息且具有无创收集、标本处理相对简便的优势，因此，利用尿液中所蕴含的丰富生物学信息，通过建立新型、敏感的高通量检测技术，实现对肾脏纤维化的无创、动态监测提供全新的技术手段。而目前尚无基于PCR芯片技术检测尿液中肾脏纤维化特异性mRNA方法构建的报道。

发明内容

本发明的目的是从新鲜尿液中提取肾脏脱落细胞的遗传物质，通过实时荧光PCR方法，一次性高通量检测肾脏纤维化形成过程中，发挥关键作用的基因，并对基因的表达量进行相关性分析。产品是一种利用PCR孔板作为PCR芯片，每块芯片检测1个样本，采用实时荧光PCR的方法检测受试者样本中标志基因的表达水平，利用计算机软件评估受试者是否患有肾脏纤维化及其严重程度。

采用的技术方案是：

基于实时荧光PCR的尿沉渣细胞肾脏纤维化检测芯片，其特征在于，包括与如下3个肾脏纤维化相关mRNA对应的引物：ACE、CD71、CCL5(RANTES)。

在使用该芯片时，是需要对新鲜尿液中提取肾脏脱落细胞的mRNA反转录为cDNA后，再进行实时荧光PCR扩增并对基因表达进行检测和分析的。

引物设计原则是：

根据基因名称，通过GENEBANK在NCBI上检出相应基因序列，用PRIMER软件设计引物。按照引物的设计原则：

1）所有引物的T_m值相近，能够在同一PCR条件下高效率扩增基因；

2）所设计的引物不包含SNP位点，不在重复序列区内；

3）每对引物专一性扩增目标片段；

4）引物设计在表达基因的保守区内；

5）避免引物二聚体、发卡结构或错配；

6）引物长度设计为18bp-25bp；

7）引物的GC含量控制在35～70%。

8）设计引物，根据Blast分析结果选择引物，PCR扩增基因产物长度控制在60～300bp。

上述的3个基因所对应的引物经过大量的试验和优化，可以采用表1中所述的引物，每个基因都对应一个正向引物和一个反向引物。

表13个肾脏纤维化相关基因对应的引物

进一步地，上述的芯片可以采用PCR孔板作为载体，例如96孔PCR板等，每个基因所对应的一个正向引物和一个反向引物加在一个孔中进行PCR扩增。

进一步地，进行实时荧光PCR扩增时，还需要对管家基因进行相应的PCR扩增，本领域技术人员可以采用常规的管家基因作为参照，用于PCR芯片数据的标准化，本发明中，优选采用如下的3个管家基因作为内参基因：B2M、ACTB、GAPDH。更优选的，是以上述3个管家基因表达量的平均值作为参照值。每个管家基因所对应的正向引物和反向引物也是加在一个孔中进行PCR扩增。

对于上述的内参基因，可以采用如下的正向引物和反向引物进行扩增：

B2M：

正向引物5'->3'AGGCTATCCAGCGTACTCCA(SEQIDNO.7)

反向引物5'->3'CACGGCAGGCATACTCATCT(SEQIDNO.8)

ACTB：

正向引物5'->3'TGGCACCCAGCACAATGAA(SEQIDNO.9)

反向引物5'->3'CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA(SEQIDNO.10)

GAPDH：