[发明专利]龟纹瓢虫的特异性分子标记DNA序列、鉴别引物、鉴定方法及鉴定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及龟纹瓢虫的特异性分子标记DNA序列、鉴别引物、鉴定方法及鉴定试剂盒。 

背景技术

龟纹瓢虫Propylaea japonica(Thunberg,1781)属鞘翅目、瓢虫科，在我国大部分地区都有分布，是多种蚜虫、叶蝉、飞虱等害虫的重要捕食性天敌。龟纹瓢虫适应性强，具有耐高温、抗低温、耐饥饿等特性，并对生物农药也有一定的抗性。在我国，研究人员对其行为、生理功能都做了很多的研究，在生物防治应用中也做了相关的试验，已发现该瓢虫作为一种有效地天敌昆虫在生产应用中有很高的价值。然而，龟纹瓢虫成虫鞘翅上的色斑变化很多，属多形性物种，与鞘翅目、叶甲科的很多物种相似，从形态学上很难将其区分；在幼虫阶段，其形态不但与瓢虫科其他许多种类相似，甚至于与有些害虫相似，从形态学上更难进行鉴定。在我国被记录的瓢虫种类有750余种，作为害虫天敌的捕食性瓢虫是我国重要的利用和保护对象，而要对瓢虫种类进行准确的鉴定区分，就必须进行解剖，在显微镜下对生殖器进行观察、鉴定，一方面，对采集标本的完整性有很高要求，另一方面，需要相关的分类专家进行鉴定工作，耗时、耗力。近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，但对田间天敌昆虫的种类鉴定鲜有报道。因此，为了更好地了解龟纹瓢虫在田间的生物种群分布和数量，评价其控害效果，研究建立一种高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将会是害虫生物防治领域的关键技术之一。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供从龟纹瓢虫基因序列中克隆的，能用于鉴定龟纹瓢虫的特异性DNA序列。 

本发明根据龟纹瓢虫EST序列设计COI基因的特异性引物并进行PCR扩增，获得233bp的DNA特异性条带，对其回收、克隆、测序后进行同源性比较，确定该特异性DNA序列可作为鉴定龟纹瓢虫的特异性分子标记，用于龟纹瓢虫的鉴定、区分近缘的天敌瓢虫及形态上不易分辨的昆虫，从而实现了本发明的目的。 

本发明的鉴定龟纹瓢虫的特异性DNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明的第二个目的提供一对能鉴定龟纹瓢虫的特异性PCR引物，其特征在于，包括正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA（如SEQ ID NO.2所示）和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA（如SEQ ID NO.3所示）。 

本发明的第三个目的是提供一种能特异性鉴定龟纹瓢虫的试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR预混液和PCR引物，其特征在于，所述的PCR引物包括正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA。 

用此引物扩增田间采集的混合种群昆虫的基因组DNA样本，如有233bp扩增条带，则为混合有龟纹瓢虫物种的样本。 

本发明的第四个目的是提供一种鉴定龟纹瓢虫的方法，其特征在于，以正向引物：ATAGGAGCTGGAACAGGTTGA和反向引物：AGTAGAAGAAGAATTGCGGTGA作为PCR引物通过PCR方法对基因组DNA样本进行扩增，如有233bp扩增条带，则为混合有龟纹瓢 虫物种的样本。 

本发明有效弥补了传统分类对标本完整性要求高、需要相关领域的专业分类专家、成本高、耗时长等问题，提供的PCR引物及鉴定方法，不仅能提高龟纹瓢虫鉴定的效率和准确性，而且操作简便快捷，适合于田间检测叶甲科类和近缘瓢虫科的混合种群中是否混有捕食性的龟纹瓢虫，同时对室内养殖过程进行质量监控、对龟纹瓢虫的生防效果进行准确评估等方面，具有重要的理论意义和应用价值。 

附图说明

图1为用设计的PCR引物对16种常见昆虫DNA样本进行PCR检测的1%琼脂糖凝胶电泳图；