[发明专利]一种蛋白质快速定量方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质快速定量方法。

背景技术

将外源基因导入大肠杆菌并诱导其表达，是科学研究以及工业生产过程中获得目的蛋白的重要方法之一。该方法首先需要实验者去优化外源基因的表达条件，如选择合适的菌株、载体、表达温度等等，从而提高蛋白质的表达量并帮助其正确折叠，以获得较多的可溶性目的蛋白。另外，在蛋白质的表达过程中，我们需要在合适的时候收集细菌以提取蛋白。表达时间不足，或者表达时间过长导致的蛋白质的降解，都会降低目的蛋白的产率。为此，我们需要实时监测目的蛋白的表达情况。

一般情况下，为了获得不同条件下以及不同时间点时的表达情况，我们需要收集一定量的细菌，经破碎、离心后，将上清与沉淀分离，测定上清中目的蛋白的含量。但由于上清中还含有许多细菌本身表达的内源性蛋白，通常情况下我们需要进行分离后才能对目的蛋白进行定量。一种传统方法是取上清制备成样品进行蛋白质凝胶电泳，然后测定目的蛋白条带的大小以及灰度。但该方法比较耗时（约2h），而且要用到一些有毒试剂。另外，细菌内的某些内源性蛋白可能会与目的蛋白的条带重合，从而造成干扰。我们也可以将目的蛋白从上清中提纯出来后再对其进行定量，但这种方法同样耗费大量时间和人力。

鉴于纯化和分离过程的复杂性，许多研究者致力于寻找更加直接和快速的蛋白质定量方法。如在蛋白上引入His标签，然后利用识别His标签的酶联抗体进行斑点杂交（dot-blotting）实验来检测蛋白质表达水平（Vincentelli,R.,S.Canaan,J.Offant,C.Cambillau and C.Bignon(2005).Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in96-well format.Anal Biochem346(1):77-84.）。或在目的蛋白上融合表达一段含双抗原表位的短肽，向细菌裂解后的上清中加入两种分别识别两种表位的单克隆抗体，两种抗体分别用相互之间可以发生荧光共振能量转移的两种荧光标签标记，通过检测均相时间分辨荧光（HTRF）信号的强弱来对蛋白质定量（Enomoto,K.,K.Uwabe,S.Naito,J.Onoda,A.Yamauchi,Y.Numata and H.Takemoto(2008).A double epitope tag for quantification of recombinant protein using fluorescence resonance energy transfer.Anal Biochem380(2):249-256.）。或在C端加一半胱氨酸残基（cystope tagging），蛋白质通过该残基上的巯基与荧光素标记的马来酰亚胺通过加成反应偶联在一起，然后利用流式细胞仪检测细胞内荧光强度（Jose,J.and S.von Schwichow(2004).Cystope taggingfor labeling and detection of recombinant protein expression.Anal Biochem331(2):267-274.）。还有研究者利用荧光偏振技术（fluorescence polarization，FP），由于带有C-myc标签的蛋白与一种荧光素偶联的C-myc短肽竞争结合C-myc抗体时，会降低C-myc短肽-抗体复合物的荧光偏振信号，故可利用荧光偏振信号的减弱来指示目的蛋白含量（Sun,S.,L.H.Nguyen,O.Harold Ross,G.F.Hollis and R.Wynn(2002).Quantitative analysis of c-myc-tagged protein in crude cell extracts using fluorescence polarization.Anal Biochem307(2):287-296.）。GFP等荧光蛋白也被用来监测蛋白质的表达情况，与GFP融合表达的目的蛋白自身的荧光特性可作为检测蛋白质含量的方法（Coleman,M.A.,V.H.Lao,B.W.Segelke and P.T.Beernink(2004).High-throughput,fluorescence-based screening for soluble protein expression.J Proteome Res3(5):1024-1032；Omoya,K.,Z.Kato,E.Matsukuma,A.Li,K.Hashimoto,Y.Yamamoto,H.Ohnishi and N.Kondo(2004).Systematic optimization of active protein expression using GFP as a folding reporter.ProteinExprPurif36(2):327-332；Coutard,B.,M.Gagnaire,A.A.Guilhon,M.Berro,S.Canaan and C.Bignon(2008).Green fluorescent protein and factorial approach:an effective partnership for screening the soluble expression of recombinant proteins in Escherichia coli.Protein ExprPurif61(2):184-190.）。