[发明专利]检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因第一内含子倒位的引物、方法和试剂盒

说明书

   

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子的引物、方法和试剂盒，利用长片段PCR扩增技术可以对甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位进行检测。 

  

背景技术

血友病是一组遗传性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A(甲型）、血友病B（乙型）和遗传性因子XI缺乏症（丙型）。前两者为性连锁隐性遗传，后者为常染色体不完全隐性遗传。 

甲型血友病是一种由于凝血因子Ⅷ(Factor VIII, FⅧ)基因缺陷导致患者产生严重凝血障碍的X染色体连锁隐性遗传病，男女均可发病，但绝大部分患者为男性。 

FⅧ基因位于Xq28，长度约186kb，含有26个外显子和25个内含子。FⅧ基因不仅结构庞大，而且导致血友病A的基因突变种类繁多，其中最常见的是由FⅧ基因第22号内含子倒位突变引起的FⅧ严重缺乏，它是45％～50％重型血友病A患者的分子发病机制，而FⅧ基因第1号内含子倒位是另一常见突变，约5％的重型血友病A是由该突变所致。 

FⅧ基因第1号内含子倒位与FⅧ抑制物形成的关系：自1996年Brinke等首次发现了FⅧ基因第1号内含子可发生倒位以来，近年来越来越多的研究报道，FⅧ第1号内含子倒位是仅次于第22号内含子倒位导致重型血友病A的常见原因。目前认为，第1号内含子倒位发生率为1.2~5%之间。最近，Schroder等对德国的1127例血友病A患者的研究结果显示，有23例患者发生第1号内含子倒位，占2.04% ( 23/ 1127 )，抑制物阳性率为26.09%，明显高于其他国家。 

FⅧ基因在其第1号内含子倒位产生的分子机制与第22号内含子倒位的分子机制非常相似，其本质都是由于基因组水平上FⅧ基因内部和外部靠近远端的高度同源序列发生基因重组，从而影响FⅧ基因mRNA的形成，造成正常蛋白严重缺乏而导致重型血友病A的发生。FⅧ基因在其第1号内含子内有一段1041bp的序列(intlh-1)，和与FⅧ基因相隔约140kb处的另一段序列(intlh-2)的同源性高达99.9%。Intlh-2区域位于C6.1A基因和VBPI基因之间，其方向与intlh-l完全相反(如图1所示)。Inilh-1和inilh-2发生基因重组后形成两个嵌合的mRNA：一个mRNA包含FⅧ基因的第1号外显子及后续的VBPI基因第2号外显子到第6号外显子，受FⅧ基因的启动子调控；另一个mRNA包含C6.IA基因几乎所有编码区及后续的FⅧ基因部分第1号内含子和第2号外显子到第26号外显子，受C6.IA基因的启动子调控。由于FⅧ基因大部分编码区位于C6.1A基因终止密码子的下游并与FⅧ基因信号肽分离，因而即使这种嵌合的mRNA能够稳定存在并在肝脏中足量合成，也不可能有FⅧ蛋白分泌至外周血中。 

  

发明内容

本发明的目的是提供用一种检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的引物序列，利用该引物序列可以简便、高效、特异的检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位。 

本发明提供检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括： 

(ⅰ) 扩增FⅧ基因Intlh-1区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.2：GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA；

(ⅱ) 扩增FⅧ基因Intlh-2区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA

SEQ ID NO.4：TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。

进一步地，引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3使用浓度分别为2μM、2μM和2μM。 

进一步地，引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4使用浓度分别为2μM、2μM和2μM。 

本发明还提供检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：