[发明专利]检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因第一内含子倒位的引物、方法和试剂盒

权利要求书

1.检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的引物，其特征在于，包括：

(ⅰ) 扩增FⅧ基因Intlh-1区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.2：GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA；

(ⅱ) 扩增FⅧ基因Intlh-2区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA

SEQ ID NO.4：TGGGTGATATAAGCTGAGCTA。

2.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3使用浓度分别为2μM、2μM和2μM。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4使用浓度分别为2μM、2μM和2μM。

4.检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(ⅰ)  PCR扩增反应试剂；

(ⅱ)  权利要求1所述引物序列。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应试剂包括dNTPs、2*PCR缓冲液、Mg²⁺、Taq酶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，Mg²⁺反应终浓度为1.0mM；dNTP反应终浓度为3.0mM。

7.检测甲型血友病凝血因子Ⅷ基因的第一内含子倒位的方法，包括如下步骤：

（ⅰ） 采集待测血液样本，提取DNA；

(ⅱ) 以该DNA为模板，进行LD-PCR扩增，得到PCR反应产物，其中所述PCR引物为

扩增FⅧ基因Intlh-1区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.2：GCTCAAGCTAGGATGGCTCTGC

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA；

扩增FⅧ基因Intlh-2区域的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；其碱基序列为：

SEQ ID NO.1：AGACTTTGGGGTTGTTGGGA

SEQ ID NO.3：GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA

SEQ ID NO.4：TGGGTGATATAAGCTGAGCTA；

（ⅲ）步骤(ⅱ)中获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析检测结果。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(ⅱ)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃ 2min预变性；94℃ 30s、64℃ 30s、72℃ 3min，30个循环；72℃ 10min。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，扩增分为两管完成，第一管包含3条引物，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3；第二管包含3条引物，分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，第一管中的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3使用浓度分别为2μM、2μM和2μM；第二管中的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4使用浓度分别为2μM、2μM和2μM。