[发明专利]检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物和方法，采用Sanger测序法技术，能对人类雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列多态性进行检测，特异性好，准确度高。

背景技术

年轻女性月经过少，是一种妇科常见症状。其危害是影响孕卵在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕等，是闭经的前期症状。雌激素是调节月经的主要激素，作用体现在：一方面促进子宫内膜血管的周期性重建；另一方面促进子宫内膜的增生修复。雌激素是月经调节的主要激素，其通过与雌激素受体作用。但临床上发现一类月经过少患者其雌激素水平正常，无内外科和先天性疾病，这种疾病被称为原因不明月经过少。同时，对大量原因不明月经过少患者进行宫腔镜检查发现，许多月经过少患者的子宫内膜光滑且薄，表现为生长发育不良，与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说并不吻合。由于此类患者雌激素水平正常，所以已有研究人员推测是否是雌激素受体环节出现障碍?前期实验已证实原因不明月经过少患者其雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达减弱，这可能是雌激素受体β基因（estrogen receptor β,ERβ）发生改变而导致ER减少。

人ER是配体依赖转录活性因子超家族(类固醇激素、甲状腺激素、维生素D3、维甲酸等受体)成员之一，定位于胞浆或胞核内，具有转录因子的作用，与雌激素结合后即形成二聚体，通过与靶基因中的雌激素反应元件特异性结合，刺激靶基因转录，从而促进细胞增殖和分化。它包括ERα（estrogen receptor α）和ERβ，其中ERβ基因位于14号染色体。在ERβ基因第5内含子中，存在C(cytosine)和A(adenine)重复序列多态性。ERβ参与了雌激素对月经周期中子宫内膜的生理调节作用。鉴于在原因不明月经过少者体内雌激素水平正常，以及前期研究结果显示与月经量正常妇女相比，此类人群ERβ基因表达下降，研究人员据此推测可能ERβ减少，使雌激素对子宫内膜调节作用下降，从而引起月经量的下降。所以目前许多研究试图从ERβ基因多态性角度去探讨原因不明月经过少的发病机制，例如研究ERβ基因第5内含子中CA重复次数与原因不明月经少之间的相关性。

在临床实验室中，目前检测雌激素受体β基因CA重复序列的常用方法有Sanger测序法及焦磷酸测序法，其中Sanger测序法以自动化、方法简便、分辨率高、测序片段长等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病和肿瘤等方面的检测和诊断。但是由于ERβ基因第5内含子中存在CA重复序列。利用现有的引物和方法对这类长重复序列扩增和测序时常常会不稳定，容易发生测序中断等情况。这种测序中断现象的发生会直接影响到检测结果。另一方面据现有文献报导目前的检测下限是只能检测出0.001μg的ERβ基因DNA中的CA重复序列，在低一点DNA模板量时就检测不到CA重复了，这样的检测下限还是不能满足科学研究的要求。

因此为了让不明月经过少的发病机制研究的数据更准确，就需要对ERβ基因多态性有非常准确的检测方法以获得有价值的科研参考数据。科研工作者只有依据准确的检测数据，才可以去判断不明月经过少患者其雌激素受体表达减弱，是否与雌激素受体β基因发生改变而导致ER减少有关。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的引物，所述引物的序列为：

CAF：CCTTCAAGATAACCACCGAA

CAR：GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。

本发明还包括测序引物，所述测序引物为：

CAF：CCTTCAAGATAACCACCGAA

CAR：GGTCAGGAGTTCGAGACAAG。

本发明还提供了检测雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的方法包括以下步骤：

(1)取全血样本，加入红细胞裂解液，裂解红细胞；

(2)加入核酸提取液，提取核酸；

(3)加入PCR扩增反应液进行DNA扩增；PCR扩增的引物序列为：

CAF：CCTTCAAGATAACCACCGAA

CAR：GGTCAGGAGTTCGAGACAAG；

(4)取PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功，选取有目的条带的PCR扩增产物进行酶纯化反应；

(5)采用Sanger测序法对酶纯化产物进行测序，检测出被检样本中雌激素受体β基因第5内含子CA重复序列的重复次数。