[发明专利]一种制备植物促根剂的方法

说明书

技术领域

一种制备植物根系促生剂的方法。该方法属于生物技术领域。采用这一技术，可以快速、大规模生产质量稳定的香菇多糖、并降低其生产成本。生产的根系促生剂能有效促进植物根系的旺盛生长，而对植物的其他器官影响较小，并且不受该物质高浓度的抑制，明显优于其他植物激素或生长调节剂。可以广泛应用于农林、食品和环境等领域。

背景技术

香菇多糖对动植物具有多种有益作用，一般采用从子实体中提取，生长周期长、分离成本高。因而，香菇多糖的生产和应用受到很大的限制。采用耐酸菌丝实施深层开放式培养大规模生产，以可以克服这些缺陷。

发明内容

采用香菇子实体等来制备高活性菌丝、对菌丝进行诱变并依次通过酸性液体培养基(pH1.0-4.0)、珍珠岩固体培养基初步筛选耐酸菌丝突变体；经过多次酸性培养基继代培养和典型的拮抗测试复筛获得耐酸突变体；耐酸突变体经振荡培养形成分散良好的细胞系；优化培养工艺，在pH2.0-4.0的培养基中深层开放式培养；从发酵液收集滤液，经热水浸提→香菇粗多糖→Sevag法脱蛋白→H202脱色→透析脱盐→DEAE-纤维素(DEAE-52)柱层析→Sephadex G-100柱层析→纯多糖(中性多糖、酸性多糖)；纯多糖(中性多糖、酸性多糖)可用作植物根系的促生剂。这种方法可快速、低成本、大规模生产质量稳定的香菇多糖。

具体实施方式

1采用香菇子实体等来制备高活性菌丝

1)供试培养基

(1)PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，pH自然。选择质量好的马铃薯洗净后，去皮，挖去芽眼，削掉青绿部分。切成小块(约1.0cm×1.5cm至2.0cm×3.0cm)。称取马铃薯200g，加水约1L，温火煮沸并保持30min，马铃薯块变软时用4层纱布过滤，滤汁内加入琼脂和葡萄糖，在文火上使琼脂融化，加水补足1L，分装后加琼脂经120℃高压湿热灭菌20min。

(2)液体种子培养基(w／v)：马铃薯20％，葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂PO₄0.3％，MgSO₄0.15％，初始pH6.0。

(3)摇瓶基础培养基(w／v)：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，KH₂P0₄0.2％，MgS0₄0.1％，初始pH2.5。

2)香菇菌丝培养

(1)菌种活化

将保存于试管斜面培养基上的香菇菌种用接种铲切出0.5cm×0.5cm大小的菌块接种于倒平板的PDA培养基上，25℃恒温培养6d。

(2)液体种子培养

将已活化的斜面菌种切割成0.5cm×0.5cm大小菌块，接种于液体种子培养基中，每个250mL三角瓶接5块菌块，10个大小均一的玻璃珠，培养基装液量100mL，于25℃，150r／min培养6d，制备成发酵种子液。

(3)摇瓶发酵培养

将摇瓶菌种在25℃静置24h后，用匀浆器将其匀浆。250mL三角瓶装培养基100mL，液体菌种接种量为10％，于25℃，150r／min培养12d。

3)菌种分离及纯化

香菇菌种分离就是把香菇菌丝体从混杂的微生物环境中单独分离出来，并进行纯培养。可采用孢子分离法和组织分离法。

孢子分离得到的菌丝具菌龄短，生活力强等优点，并具有双亲遗传特性，是选育高新菌株和杂交育种的材料，但由于其染菌率过高，因而，目前香菇生产上最常使用的1种分离方法为组织分离法。即就是利用香菇子实体组织，分离培养出香菇的纯菌种。具体做法为选择个体典型，朵多，盖厚无病虫危害，最好是用未成熟的菌蕾作为分离材料。用75％酒精冲洗种菇表面进行消毒，再用无菌水冲洗干净，无菌滤纸吸干。用消过毒的刀片在菇柄中部纵切一刀，用手掰开菌盖，在菌盖与菌柄交界处取米粒大小的小块组织，移接到PDA斜面培养基上，加上棉塞，在25℃条件下培养。

菌种的纯化及扩大培养：菌种分离培养3d～4d后，选取菌丝萌发早，长势旺的菌落，转管扩大培养。经扩大培养菌种一般在8d～12d可长满管。香菇菌种肉眼观察PDA斜面上菌丝生长洁白，羽毛状沿着培养基表面延伸，至此得到试管菌种(即母种)。

4)耐酸性香菇诱变菌丝筛选

(1)紫外辐照处理