[发明专利]抗耐药性细菌感染多肽Cbf-14及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗菌多肽及其应用，本发明的抗菌多肽具有抗耐药性细菌感染的用途。

背景技术

随着抗生素的大量应用，特别是无指征用药、不恰当地选择备用抗菌药、过度治疗及频繁换药，导致细菌的耐药率越来越高，耐药程度越来越严重。自发耐药突变的存在与抗生素选择压力的持续作用，以及病原菌的环境适应能力与人体微环境生态变化的进化催动，是临床上耐药菌和多重耐药菌产生的基础。多重耐药菌，广义上包括广泛耐药菌或超级细菌，其产生和发展给临床诊治带来了巨大的挑战。

抗菌肽是一种很有潜力的新抗菌药物来源，由于其独特的抗菌机理和多样的生物活性，自研发至今，其研究及应用已成为生物制药和临床医学领域中的热点。与传统抗生素相比具有分子量小、抗菌谱广、抗菌机理独特、不易产生耐药性等优点。阳离子抗菌肽被广泛定义为少于50个氨基酸的富含正离子的多肽，且有一半或以上的疏水残基。多肽的所含的正电荷来源于赖氨酸和精氨酸所携带的正电荷。大多数抗菌肽具阳离子性和双亲性，因长度、电荷数、氨基酸序列和二级结构的位置不同而多肽的特性不同。多肽按照其二级结构分为四类，分别是α螺旋、β片层、无规则卷曲和线性肽。这种多肽具有广谱杀菌作用，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有效果。一些抗菌肽还有其他生理活性，抗病毒，抗癌，促进伤口愈合，激活免疫应答等。阳离子多肽的这些特性使得其成为新的治疗药物的有力候选者。阳离子抗菌肽的作用机理的研究也越来越广泛。抗菌肽的作用机理有很多种，有些可以使细胞膜透化，有些作用于细胞壁，还有一些抑制细胞内大分子的合成。

但目前，抗菌肽的发展存在三大瓶颈，即：抗菌肽的生产成本高；抗菌肽的毒性较大；抗菌肽对蛋白酶体的稳定性差。已有诸多学者研究表明可从设计上改善原有抗菌肽的结构，保留其活性位点，缩减肽链，以减少抗菌肽的生产成本。在进行抗菌肽设计的时候，需要考虑到毒性及稳定性等因素，使其与原有天然抗菌肽在毒性及稳定性方面保持一致，通过统筹电荷、疏水性、二级结构等诸因素，使其更加低毒高效稳定。

发明内容

本发明依据Cathelicidin家族的抗菌多肽，将其部分活性氨基酸位点进行突变，采用固相化学合成法获得对青霉素耐药性细菌具有高抑制活性的抗菌多肽，本发明抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID：NO:1所示。简称Cbf-14，全序列为：精氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸。

Cbf-14是将Cbf-K₁₆的C端氨基酸进行截短，同时加入α螺旋重复序列，采用固相化学合成法获得了对细菌及其耐药株具有高抑制活性的具有14个氨基酸的抗菌肽突变体。经改造后，其含有7个正电荷，分子量为1819.33，等电点为12.31。固相合成成本降低了2/3，毒性没有明显变化，因此大大解决了抗菌肽的生产成本高的问题，有利于抗菌肽在治疗耐药细菌感染方面的应用。

采用固相化学合成法即可得到本发明的抗菌多肽。

体外抗菌活性研究表明，本发明的多肽Cbf-14具有显著的杀灭耐药性细菌的作用，可用来制备抗耐药性细菌感染的药物。所述耐药性细菌优选金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌。

抗菌肽在杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏及抗菌肽能否使小鼠原代脾细胞发生死亡作为是否有毒性的一个标准。如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测OD₅₄₀测定其毒性大小。因此本发明还检测了本发明的抗菌肽Cbf-14对绵羊红细胞的溶血活性。实验表明，本发明抗菌肽的溶血率很低。同时本发明发现在实验浓度范围内，本发明的抗菌肽对小鼠脾细胞没有毒性作用。结果证实，本发明抗菌肽的毒性极小。

附图说明

图1是本发明抗菌肽Cbf-14的HPLC图谱

图2是Cbf-14的Mass图谱

图3是Cbf-14的圆二色谱

图4是Cbf-14对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的杀菌曲线

图5是Cbf-14对青霉素耐药的表皮葡萄球菌的杀菌曲线

图6是Cbf-14对青霉素耐药的大肠埃希菌的杀菌曲线

图7是Cbf-14对青霉素耐药的铜绿假单胞菌的杀菌曲线

图8是Cbf-14对青霉素耐药的肺炎克雷伯菌的杀菌曲线

图9是Cbf-14对绵羊红细胞的溶血曲线