[发明专利]一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用，尤其涉及一种利用突变的噬菌体裂解基因E制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及由该方法获得的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗，及其在制备防治副猪嗜血杆菌感染药物中的应用，本发明属于基因工程疫苗领域。

背景技术

细菌菌影（Bacterial ghost）是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为“细菌菌影”。细菌菌影是由内膜(cytoplasmic membrane)，胞浆间隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为细菌菌影的成分之一。细菌菌影本身可作为一种很好的疫苗，因为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖，肽聚糖，CPG，OmpA，菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前，菌影通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。霍乱菌菌影（VCG）经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外，细菌菌影还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组菌影拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结（Peyer’s Patches）的M细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体（C.trachomatis）抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组菌影(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Th1型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组细菌菌影有几大优势：(1)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)菌影的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。

裂解基因E的表达可在λpL/pR-cI857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转录控制下完成。一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性裂解质粒已经被构建出来。λpR启动子和温敏阻遏物cI857在30℃以下能抑制基因E的表达，高于30℃会导致阻遏物cI857热灭活而诱导E基因表达。为了制备菌影，细菌须在28℃条件下生长到对数生长期，然后升温到42℃诱导其裂解。

E蛋白介导的裂解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博德特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要E基因裂解盒被引入到适当的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。

目前，国内外现有的制备细菌菌影的裂解质粒载体系统都是在上述28℃条件下培养增殖细菌，然后再升温到42℃诱导E基因的表达制备细菌的菌影。但是，大多数细菌的最佳生长温度都是37℃，28℃条件下培养使得很多细菌的生长速度大大下降，而且不利于天然表面抗原的形成，影响疫苗的免疫原性和保护效果。本发明将E基因的启动区突变后不但使得初始培养温度从28℃提高到37℃，克服了菌影制备速度慢和免疫原性差的缺陷，而且裂解效率也提高了1～2个数量级。更为关键的是，基于突变后的E基因Eprom构建的裂解载体pBV-Eprom能够利用发酵罐大量地制备副猪嗜血杆菌的菌影，使规模化生产成为可能，而该方面并未见相关的研究报道。