[发明专利]一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用。

技术背景

由于化石能源危机的日益严重以及利用化石能源带来的环境问题，制造生物燃料成为迫切问题。生物柴油是生物燃料的重要组成部分。随着生物柴油的大量生产，积累了大规模作为副产物的甘油。据估算，每生产10吨生物柴油大约生成1吨粗甘油。甘油的生产增长迅速，致使甘油价格一直较低，且还将会持续下降。充分利用甘油这种来源丰富、价格低廉的原料，可以带来巨大经济和环境效益。

3-HP是一种重要的平台化合物。以3-HP为底物可以合成一系列具有较高商业价值的化学物质，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙烯酸甲酯、丙二酸、丙烯酰胺、羟基酰胺等。由3-HP还可以用于生产涂料、胶粘剂、抗冻剂、吸水树脂等高附加值产品。P3HP是一种非常有发展前景的生物降解性塑料，其生物材料性质和机械性能优良，如具有高机械强度和延展性、高断裂伸长量、生物兼容性、生物降解性、压电性、热塑性、不溶于水、无毒等。对比研究较多的生物降解性塑料聚乳酸（PLA）和聚3-羟基丁酸（PHB），P3HP比PLA具有更好的稳定性而不易水解，因碳链骨架中不含甲基而比PHB更易被微生物降解。基于其优良性能，P3HP可以被用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控制、包装等领域。

3-HP和P3HP均可以通过化学合成获得，但是化学合成途径具有原料受限、成本居高不下以及容易造成环境污染等问题；与化学法相比，生物合成操作简单、条件温和、绿色环保。越来越多的科研工作者将研究重点放在了生物合成途径上。

已知的由甘油制备3-HP的微生物包括脱硫弧菌属的Desulfovibrio carbinolicus和Desulfovibrio fructosovorans、威尼斯暗杆菌（Pelobacter venetianus）、罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）和多营养泥杆菌（Ilyobacter polytropus），但是，以上微生物合成3-HP的产量很低，代谢途径不清。可以直接合成P3HP的微生物尚未发现。研究人员把研究重点放在了构建基因工程菌合成3-HP或P3HP上。

已报道的3-HP或P3HP的合成只针对二者中某一种的合成，尚未发现以同一菌体为宿主实现3-HP和P3HP同时合成的报道。

发明内容

本发明提供了一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，是将甘油脱水酶基因（dhaB123）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB），醛脱氢酶基因（aldH），丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）以及聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC）导入宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌；所述重组肺炎克雷伯氏菌是敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到的。

本发明不仅克隆了E.coli醛脱氢酶基因aldH，同时克隆了K.penumoniae的甘油脱水酶基因dhaB123及甘油脱水酶激活再基因gdrAB，构建重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB，以甘油为底物达到合成3-HP的目的。

本发明克隆了丙酰辅酶A合成酶基因（prpE）和聚羟基脂肪酸合成酶基因（phaC），构建了重组质粒pBAD18-phaC-prpE。

本发明所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，是敲除了与副产物1,3-丙二醇合成相关的基因1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT和醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD，达到减少副产物1,3-丙二醇的合成并提高目的产物3-羟基丙酸产量的目的。

本发明通过将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌实现3-HP和P3HP的联产。

所述甘油脱水酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。

所述甘油脱水酶再激活酶基因来自肺炎克雷伯氏菌。

所述醛脱氢酶基因来自大肠埃希氏杆菌。

所述丙酰辅酶A合成酶基因来自大肠埃希氏杆菌。

所述聚羟基脂肪酸合成酶基因来自产碱杆菌属真氧产碱杆菌。

所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，为缺失了1,3-丙二醇脱氢酶基因（dhaT）和醛还原酶/醇脱氢酶基因（yqhD）的菌株。

所述醛脱氢酶基因（aldH）、甘油脱水酶基因（dhaB123）和甘油脱水酶再激活酶基因（gdrAB）通过重组载体pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB（pEdg）导入所述宿主菌中。