[发明专利]一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，包含：将甘油氧化为3-羟基丙醛的酶，将3-羟基丙醛氧化为3-HP的酶，将3-羟基丙酸转化为3-羟基丙酰辅酶A的酶，将3-羟基丙酰辅酶A聚合为聚3-羟基丙酸的酶。

2.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，是将甘油脱水酶基因，甘油脱水酶再激活酶基因，醛脱氢酶基因，丙酰辅酶A合成酶基因和聚羟基脂肪酸合成酶基因导入宿主重组肺炎克雷伯氏菌，得到重组菌；所述重组肺炎克雷伯氏菌是敲除了1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到的。

3.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌，其特征在于，该菌株是将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到重组菌；所述重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB是在质粒pBAD33中插入克隆所得醛脱氢酶基因，甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活基因得到的重组质粒；所述pBAD18-phaC-prpE，是在质粒pBAD18中插入聚羟基脂肪酸合成酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因得到的重组质粒；所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌，是缺失了1,3-丙二醇脱氢酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因的重组菌株。

4.一种联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）克隆醛脱氢酶基因，同时克隆甘油脱水酶基因及甘油脱水酶再激活基因，构建重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB；

2）克隆聚羟基脂肪酸合成酶基因和丙酰辅酶A合成酶基因，构建重组质粒pBAD18-phaC-prpE；

3）敲除肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇氧化还原酶基因和醛还原酶/醇脱氢酶基因得到宿主重组肺炎克雷伯氏菌；

4）将重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB和pBAD18-phaC-prpE导入到宿主重组肺炎克雷伯氏菌得到联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述宿主重组肺炎克雷伯氏菌构建方法如下：

1）以肺炎克雷伯氏菌1,3-丙二醇脱氢酶基因上下游500个碱基片段为模板设计引物，PCR扩增1,3-丙二醇脱氢酶基因上下游片段，再利用回收试剂盒回收目的基因片段，以上述回收片段为模板进行搭桥PCR，再利用回收试剂盒回收目的片段ΔdhaT，以自杀质粒pRE112为媒介与肺炎克雷伯氏菌进行同源重组敲除dhaT基因得到K.penumoniaeΔdhaT；

2）在K.penumoniaeΔdhaT基础上以上述步骤1）所述方法继续敲除醛还原酶/醇脱氢酶基因得到K.peneumoniaeΔdhaTΔyqhD。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB构建方法如下：

1）醛脱氢酶基因的克隆是以E.coli为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段；

2）甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因的克隆是以肺炎克雷伯氏菌为模板，通过PCR扩增获得，再利用回收试剂盒回收目的片段，以甘油脱水酶基因段和甘油脱水酶再激活酶基因片段为底物，通过搭桥PCR获得dhaB123-gdrAB；

3）将质粒pBAD33和割胶回收后的aldH基因片段进行酶切，回收酶切产物，再进行连接，连接产物转化E.coliDH5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pBAD33-EaldH；

4）以质粒pBAD33-EaldH和割胶回收后的dhaB123-gdrAB基因片段进行双酶切，得到重组质粒pBAD33-aldH-dhaB123-gdrAB。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，重组质粒pBAD18-phaC-prpE构建方法为：对质粒pBAD18和pET21a-phaC-prpE进行双酶切，将酶切后的pBAD18和phaC-prpE片段酶连后得到重组质粒pBAD18-phaC-prpE。

8.一种联产3-HP和P3HP的方法，其特征在于，以权利要求1所述的联产3-HP和P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌发酵生产3-羟基丙酸和聚3-羟基丙酸。