[发明专利]一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf。

本发明涉及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体，含有抗除草剂的筛选基因Bar。

本发明涉及球孢白僵菌BbAzf基因的敲除突变体，该突变体可以大量产生红色色素——卵孢素。与球孢白僵菌野生型菌株相比，BbAzf突变体对农业害虫菜青虫有较高的毒力。

背景技术

真菌发育的一个重要方面是产生次生代谢物。这些次生代谢物尽管对真菌的生长和发育不是必需的，但却是真菌在生态环境中的稳定或致病动植物不可缺少的。部分真菌次生代谢物在生物技术和医药领域有着重要的作用，展示了广谱的抗生素、抗病毒、抗肿瘤、抗高胆固醇和免疫抑制活性，如青霉素和环孢菌素等；而另外一些则对动物或人类健康构成了威胁，如黄曲霉素和T-2毒素等。因此，长期以来，真菌次生代谢物的研究一直受到研究者的广泛关注。昆虫病原真菌在生长发育或致病昆虫的过程中产生的一些次生代谢物被证明与真菌的毒力相关，如白僵菌素（Beauvericin）、破坏素等。Xu et al.从球孢白僵菌中克隆了白僵菌素的非核糖体酶合成基因BbBeas，并分析了该基因对菌株毒力的影响。结果显示，当敲除BbBeas后，菌株不能产生球孢白僵菌素，对Galleria mellonella，Helicoverpa zea，Spodoptera exigua等昆虫的毒力显著降低。在接种后7天，野生型菌株可造成约70～98％的死亡率，而基因敲除突变株仅有10～23％的死亡率(Xu et al.，2008)。此外，Wang et al.通过比较基因组学手段克隆了绿僵菌的破坏素（Destruxins）合成酶基因DtxS1。研究发现产破坏素株系的宿主范围广，而不产破坏素株系的宿主范围窄(Wang et al.，2012)。这些研究表明，昆虫病原真菌产生的对昆虫具有毒性的次生代谢物在真菌侵染致病昆虫的过程中发挥着重要的作用，可望利用其提高菌株的毒力或开发出新型的生物农药。但目前从昆虫病原真菌中鉴定出来的与真菌毒力相关的次生代谢物还相对较少，已知的多数次生代谢物也仅知道其化学结构，缺乏对其合成基因及调控机理的深入认识。

球孢白僵菌是我国应用较为广泛一种昆虫病原真菌，在发育过程中会产生一种次生代谢物——卵孢素(Eyal et al.，1994)。卵孢素是一种红色的羟基苯醌衍生物，具有抗菌和抗肿瘤活性(Mao et al.，2010)，其活性机制主要是通过还原反应改变蛋白质和氨基酸上的巯基，从而使酶失活或者抑制ATPase活性。卵孢素也可以抑制Herpes simplex病毒－IDNA聚合酶的活性，从而抑制病毒活性（for a review，Strasser et al.，2000）。此外，研究发现卵孢素具有杀虫活性。尽管卵孢素在医药领域及害虫防治等领域具有广阔的应用前景，但目前仅确定了卵孢素的化学结构，对其合成基因、调控机制及与菌株毒力关系的认识还是空白。目前，卵孢素人工合成的成本较高，还没法进行大规模的生产，因此建立卵孢素的生物合成途径及调控机制可为生物发酵生产卵孢素奠定基础。

卵孢素已证实具有杀虫、抗菌及抗病毒活性，在害虫防治、植物抗病及医药卫生领域具有广阔的应用前景，但利用人工合成的方法获得卵孢素成本较高。目前关于真菌中卵孢素的生物合成途径及调控机制还不清楚，也没有通过基因工程手段获得高产卵孢素菌株的报道，因此利用真菌发酵法获得卵孢素的得率较低。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一个球孢白僵菌的C2H2型锌指蛋白基因BbAzf，解决人工合成成本较高，不能进行大规模的生产的问题。

本发明还提供所述C2H2型锌指蛋白基因BbAzf的基因敲除载体。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：

一种真菌C2H2型锌指蛋白BbAzf，其特征在于，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

进一步，本发明还提供一种球孢白僵菌BbAzf的基因敲除载体，其特征在于，通过破坏BbAzf基因以提高球孢白僵菌中卵孢素的产量，获得BbAzf的球孢白僵菌基因敲除子；

破坏该基因的方法，包括如下步骤：

1）以球孢白僵菌基因组作模板扩增得到BbAzf基因的左臂BbAzfL和右臂BbAzfR，亚克隆到pGEM-T上，获得pGEM-BbAzfL和pGEM-BbAzfR；