[发明专利]对配备有相位板的TEM中的样本进行成像

说明书

技术领域

本发明涉及形成透射电子显微镜中的样本的图像的方法，用电子束照射样本，并且样本将电子束分裂成非衍射(非散射)电子束和衍射(散射)电子束，电子显微镜配备有选自相位板、佛科装置或希尔伯特装置的对比度增强装置，该对比度增强装置用于改进低空间频率下的对比度，对比度增强装置被定位在物镜的后焦平面中或者所述平面的图像中，对比度增强装置呈现出相对无散射电子束的位置。 

背景技术

从K.Nagayama等人的“生物电子显微镜中的具有相位板的相位对比增强装置（Phase Contrast Enhancement with Phase Plates in Biological Electron Microscopy）”(Microscopy Today，Vol.18 No.4，2010年7月，第10-13页，又称作Nagayama [-1-])已知这种方法。 

在透射电子显微镜(TEM)中，用基本上平行的电子束来照射样本，其中可选择的能量通常在50与300 keV之间，尽管已知使用更高和更低的能量。样本是通常厚度在20 nm与1 μm之间的极薄样本。因此，电子的一部分通过样本，一些电子未散射(因而没有改变能量或方向)，一些电子弹性地散射(因而没有或几乎没有改变能量，但是具有方向的变化)，以及一些电子无弹性地散射(因而具有方向和能量的变化)。弹性散射电子（又称作衍射电子）和无散射电子均通过强放大透镜在图像平面中成像，其中衍射和无散射电子相互干涉来形成图像。 

要注意，其它对比度机制也有助于成像，例如局部地吸收到样本中，或通过对比度增强装置来吸收的电子的局部缺失。 

特别是主要包含低Z材料的生物样本呈现出弱相位图像。对比度是空间频率的函数，因此特别是在低空间频率，对比度为低。这通过如Nagayama[-1-]，更具体来说是图2所示的对比传递函数(CTF)来描述。其原因在于，在低空间频率，电子在小角度上被衍射，因此衍射和非衍射电子的相位差小。 

为了改进低空间频率下的对比度，可以将相位板引入到物镜的后焦平面，相位板也被称作衍射平面。物镜的后焦平面是图像的傅立叶表示，以及在这个平面，电子被散射的角度导致在这个平面中的不同位置。在这个平面中，有可能对于除了无散射射束之外的所有电子引入例如-π/2的相移。这时经相移的散射射束与无相移的非衍射电子的干涉导致高得多的CTF，如上述Nagayama[-1-]的图2所示。 

Nagayama[-1-]描述在衍射平面中使用的若干对比度增强装置。当讨论所谓的泽尔尼克相位板时，这是具有厚度的薄膜，该厚度对通过其中的电子造成大约-π/2的相移。它是碳膜，因此几乎所有通过它的电子，没有吸收或散射。在该膜的中心，形成小孔以用于使无散射电子束通过。从而造成散射与无散射电子之间π/2的相移，并且相位变化改变成幅度变化(类正弦CTF改变成类余弦CTF)。 

这个相位板的一个缺点在于，图像呈现出“环状波纹”形式的伪像。由于相位板的陡沿而引入傅立叶域中的0→–π/2的突然转变，导致普通图像平面中的纹波。这在R.Danev等人的“优化TEM的相位板的相移和起始周期数(cut-on periodicity)(Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM)”(Ultramicroscopy 111(2011)，第1305-1315页，又称作Danev[-2-])中更详细进行了说明。 

所述相位板的另一个缺点在于，薄膜的小的不平整或者其上的灰尘微粒，造成相位的局部扰动。 

又一个缺点在于，孔需要是极小的孔，因为通过孔的电子具有相同相移，因而所有这些电子呈现出几乎没有对比度。孔直径决定通过它的电子的接受角，因而决定对比度增强开始的空间频率。沿用如Danev[-2-]中第1305页，右栏所述的“起始周期数”的定义，(“起始周期数对应于相位CTF开始的空间频率，并且与相位板的中心孔的直径成反比。重影伪像在透明化单元（vitrified cell）应用中会极为显著……”)“起始周期数”或“起始频率”应当尽可能小，以在尽可能低的空间频率下实现对比度。 

相关联问题在于，(非衍射)射束需要相对于对比度增强结构居中得非常好。 

发明内容

本发明旨在提供对上述问题的解决方案。 

为此，按照本发明的方法的特征在于，在图像形成期间，改变对比度增强装置和无散射电子束的相互位置。