[发明专利]一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，专用于鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的鉴别诊断，属于生物技术领域。

背景技术

鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis）又称鸭肝炎，俗称“背脖病”。5周龄以下的雏鸭对该病易感，其中3周龄内的雏鸭最易感且死亡率高，部分可达90%以上。该病波及面广、发病率高、危害严重，是影响我国养鸭业发展的主要疾病之一。该病由鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起，分为A、B、C三个基因型，目前在我国流行的主要是A型和C型。

新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）感染是近几年发生的一种严重危害我国养鸭业的新型疾病。该病可感染不同品种、不同日龄的鸭群，但以3周龄内的雏鸭感染最为常见，也最为严重，死亡率可达50%以上。新型鸭呼肠孤病毒与禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）以及传统的番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）在基因序列、生物学特性、抗原相关性方面均存在较大差异。

鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒在发病特点、临床症状、病变特征等方面十分相似，具有以侵害雏鸭为主、发病快、死亡率高、病变以肝脏出血为主等共同特点，在临床上很难区分。而这两种疾病的治疗都以抗体注射为主，因此只有将两者区分开，给予相应的抗体，才能取得很好的疗效。利用PCR技术快速、准确、敏感性高的特点，研制鸭甲肝病毒和新型鸭呼肠孤病毒检测试剂盒来区分这两种疾病，这在实际生产中是急需的。但是目前还没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的是利用双重PCR技术建立一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，该试剂盒具有快速、准确、敏感性高、特异性好等特点，很好地解决了鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染在临床上难以区分的问题。

本发明的技术方案是：一种鉴别鸭甲肝病毒与新型鸭呼肠孤病毒感染的试剂盒，其特征是，包括以下组分（50次量）：

1）TRIZol（总RNA抽提试剂）：50ml；

2）RT反应液：900μL，包括10mmol/L dNTP50μL、5×RT缓冲液200μL、20pmol/μL检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2各50μL、40U/μL RNA酶抑制剂25μL、DEPC水425μL；

3）反转录酶M-MLV：50μL，浓度为200U/μL；

4）PCR反应液4500μL：ddH₂O4000μL、10×PCR缓冲液450μL、5U/μL Taq DNA聚合酶50μL；

5）阳性质粒：重组质粒T-DHA和T-NDR混合物250μL，终浓度均为0.1ng/μL；

6）DEPC处理水：2ml。

上述试剂均购自大连宝生物（TAKARA）公司。

所述检测引物DHA1、DHA2、NDR1、NDR2依次为：

DHA1（上游引物）：5'-CTTTCYATCAATGACCARCG-3'（SEQ NO.1）

DHA2（下游引物）：5'-GHADTTGMTCCATAACATCCTG-3'（SEQ NO.2）

（R＝A或者G；M＝A或者C；Y＝C或者T；H＝A、T或者C；D=G、A或者T）

上述引物用于检测鸭甲肝病毒，扩增片段大小为304bp；

NDR1（上游引物）：5'-GTAAGCAACCTCAGGATATCG-3'（SEQ NO.3）

NDR2（下游引物）：5'-TCATGTCGCGCGTCGTAT-3'（SEQ NO.4）

上述引物用于检测新型鸭呼肠孤病毒，扩增片段大小为148bp。

所述重组质粒T-DHA的详细制备方法：

按照TRIZol试剂说明提取A型鸭甲肝病毒RNA，利用引物DHA1/DHA2进行RT-PCR，扩增目的条带，反应条件如下：

RT反应体系（20μL）：10mmol/L dNTP1.0μL、5×RT缓冲液4.0μL、20pmol/μL的引物DHA21.0μL、40U/μL RNA酶抑制剂0.5μL、RNA模板1μL、DEPC水11.5μL；置于PCR扩增仪进行反应，200U/μL反转录酶M-MLV1μL于70℃5min后加入；反应程序：70℃5min，42℃30min，95℃2min。