[发明专利]一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌的方法。

技术背景

大肠杆菌O157:H7是近30年来才被发现和识别的食源致病菌，按血清型分类属肠出血性大肠杆菌（Entero Hemorrhagic Escherichia coli,EHEC）。它以食物传播为主，主要的宿主是牛和鸡等家畜家禽。人类摄入不到10个活菌就有可能引起出血性结肠炎（Hemorrhagic colitis HC）和溶血性尿毒综合征（Hemolytic uremie syndrom HUS)，患者病死率极高，其对人类的健康构成了严重的威胁。自1982年美国首次爆发大肠杆菌O157:H7引起的感染性腹泻以来，世界各国相继爆发了多起大肠杆菌O157:H7的流行事件。1986年在中国江苏徐州首次报道了大肠杆菌O157:H7的病例，随后在中国十几个省份也发生散发病例。其流行性已经不再是个别国家的问题，而是成为世界重要公共卫生问题之一。

目前检测大肠杆菌O157:H7方法有常规培养法和免疫法等，常规培养法耗时且工作量大；免疫磁珠捕获法由于方法自身的局限性，检测的灵敏度低且造成一定程度的漏检。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的大肠杆菌O157:H7活菌。

rfbE基因是编码大肠杆菌O157:H7的O157抗原基因，本试剂盒针对rfbE基因设计引物特异性强。设计扩增的rfbE基因的片段见Seq NO.1。

发明内容

本发明是目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、检测结果准确可靠、检测快速高效、灵敏度高的大肠杆菌O157:H7试剂盒及快速检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒，其特征在于其含有rfbE上游引物（5’→3’）：TCCATTTATACGGACATCCAT，见Seq NO.2;

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA见Seq NO.3;

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT见Seq NO.4;

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC见Seq NO.5。

上述试剂盒还含有偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，PBS磷酸盐缓冲液，添加有0.02%吐温的磷酸盐缓冲液，PMA溶液，Taq mix。

一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法包括如下步骤：

（1）取食物样本，加PBS磷酸缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；

（2）取1mL上述菌悬液加入到灭菌离心管中，加入制备好的免疫磁珠0.05mg，室温下以10rpm转速于旋转混合仪上反应45min后，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清，加入到灭菌离心管中备用。最后，添加1mL加有0.02%吐温的磷酸缓冲液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积磷酸缓液重悬磁珠。

（3）向步骤2的重悬液加PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

（4）PCR反应，PCR反应所用的引物为：

rfbE上游引物（5’→3’）：TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC

体系为20μL，其中DNA模板2μL，2×Taq mix5μL，上下游引各为0.25nmol，无菌水补足20μL。PCR反应条件为：95℃预变性10min,紧接着94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30个循环，最后72℃延伸10min。