[发明专利]一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用。 

背景技术

在细菌中，细菌外膜蛋白和分泌至胞外的分泌蛋白合称跨膜输出蛋白（exported protein），编码这些蛋白的基因占到全部基因的20%至30%。跨膜输出蛋白包括为适应体内缺铁环境而表达的转铁膜蛋白、细菌的外毒素、多杀性巴氏杆菌的交叉保护因子等，在细菌的侵袭力和产毒素能力、以及人和动物机体对病原菌的识别和免疫应答等方面都起着重要的作用，对它们的深入研究可以为人类和畜禽细菌性传染病的预防和控制提供线索。 

大部分跨膜输出蛋白的跨膜分泌是由其前蛋白（preprotein）N-末端的信号肽驱动，这些跨膜输出蛋白约占细菌编码基因组的17%。信号肽往往由带正电的氨基端结构域（n-区域）、中间的疏水跨膜区（h-区域）和极性的羧基端结构域（c-区域）三部分组成，并含有信号肽切除的位点。这些特点为计算机自动化分析预测蛋白提供了理论依据，并开发出了许多预测软件。如基于神经网络（neural networks，NN）方法、隐马科夫模型（hidden Markov models，HMM）方法开发的软件SignalP是预测信号肽和剪切位点较有效的方法，其准确性也结合实验方法进行了验证。 

目前对病原菌跨膜输出蛋白的实验研究主要采用常规的蛋白提取、SDS-PAGE电泳、单克隆抗体制备、Western blot以及双向电泳和蛋白质序列质谱分析等蛋白质组学方法，操作相对费时费力。 

余旭平，朱军莉，姚雪萍等提供了利用DNA的可扩增性，应用缺失信号肽和启动子的β-内酰胺酶基因作为报告子，构建跨膜输出蛋白基因选择克隆载体pMBL（余旭平，朱军莉，姚雪萍等，“捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证”。浙江大学学报，2004，30（2）：127～132．）。该pMBL载体用无启动子和信号肽序列的β-内酰胺酶（可分解氨苄青霉素（Amp））基因作为报告基因，当外源跨膜蛋白基因被克隆入β-内酰胺酶基因上游时，跨膜蛋白所携带的信号肽会驱动跨膜蛋白和β- 内酰胺酶共同表达分泌到菌体胞外，这样分泌到胞外的β-内酰胺酶可降解培养基中的Amp，使细菌能够在Amp平板上生长。而不含信号肽序列的基因被克隆入β-内酰胺酶基因上游时，由于无信号肽，不能驱动β-内酰胺酶向胞外分泌，细菌就不能抵抗Amp，不能在Amp平板上生长。因此，通过利用该载体，通过常规的酶切、连接等分子生物学手段即可实现跨膜输出蛋白基因的鉴定，大大简化了操作。 

尽管如此，上述载体仍然存在一定的缺陷，如：该载体pMBL能够有效地克隆含启动子和信号肽序列的基因，但是对于无启动子或者体内特殊信号诱导表达的跨膜输出蛋白基因无能为力。 

其次，在构建文库对细菌的跨膜输出蛋白基因进行系统研究时，采用pMBL载体需要构建三个文库才能全部覆盖基因组的所有基因。 

pMBL载体带有三个酶切位点（BamH I,Bcl I,Bgl II），该三位点分别以三种不同的阅读框对应于下游的β-内酰胺酶报告基因，而这三种酶与Mob I（或Sau3AI）均可产生相同的粘性末端即GATC。在采用pMBL载体进行基因组文库构建时，需要将基因组DNA用Mob I（或Sau3AI）部分酶切制备随机片段，而Mob I（或Sau3AI）位点在基因组DNA中的位置是固定的，Mob I（或Sau3AI）酶切后会产生三种不同阅读框架的的随机DNA片段，为了使DNA片段中这些不同阅读框架的基因均能与下游的β-内酰胺酶报告基因对位融合，只能用BamH I,Bcl I,Bgl II酶切pMBL质粒上位于不同阅读框的三种位点，制备三种载体，构建三个不同阅读框的文库，工作量大；另外，载体酶切后，为防载体自连，需要进行脱磷，而脱磷会导致载体连接效率低下。。 

发明内容

为克服上述缺陷，本发明提供了一种T载体，与宿主菌的相容性好，连接效率高，能够以直接克隆随机PCR产物的方式选择性地克隆和筛选含有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因，无论该跨膜输出蛋白基因是否带有活性启动子，且进行筛选跨膜输出蛋白基因时，只需构建一个基因文库，操作便捷、成本低。 

一种T载体，通过如下方法构建： 

（1）将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体； 

（2）在所述重组克隆载体的β-内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm I酶切位点，得到前T载体；