[发明专利]一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用

权利要求书

1.一种T载体，其特征在于，通过如下方法构建：

（1）将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体；

（2）在所述重组克隆载体的β-内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm I酶切位点，得到前T载体；

（3）限制性内切酶Xcm I酶切所述的前T载体，回收线性化载体，得到所述的T载体。

2.如权利要求1所述的T载体，其特征在于，所述的阿拉伯糖启动子来源于大肠杆菌（E.coli），其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的T载体，其特征在于，步骤（1）为：设计分别带Xba I和EcoR I酶切位点的引物，扩增阿拉伯糖启动子；Xba I/EcoR I双酶切扩增产物，定向克隆到Xba I/EcoR I双酶切的pMBL载体上，得到重组克隆载体。

4.如权利要求1所述的T载体，其特征在于，步骤（2）为：制备含两个Xcm I酶切位点的双连接头；将所述的双连接头与酶切的重组克隆载体连接，得到前T载体。

5.如权利要求4所述的T载体，其特征在于，所述双连接头两条链的核苷酸序列分别为，

第一条链：5`ATGAATTCCAGGTCTAAGCTGGCCACCGGAAGACTGGAATTCTA3`；

第二条链：5`TAGAATTCCAGTCTTCCGGTGGCCAGCTTAGACCTGGAATTCAT3`。

6.如权利要求1～5任一项所述的T载体在体外筛选细菌跨膜输出蛋白基因中的应用，其特征在于，包括：

（1）以细菌的基因组DNA为模板，用随机引物和Klenow片段进行基因组DNA的延伸；以延伸后的基因组DNA为模板，采用第二引物进行随机PCR；所述第二引物的碱基序列与随机引物的5’端非随机碱基相同；

（2）将随机扩增产物连入T载体，转化宿主菌，构建得到基因文库；

（3）对所述的基因文库进行筛选，获得跨膜输出蛋白基因。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的细菌具体可以为大肠杆菌（E.coli）O₂。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述随机引物的碱基序列为：

5’-AAGTCGACGGATCCGGTACCTNNNNNNNN-3’；

其中，N为A、T、C和G四种碱基的任一一种。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所选取的随机扩增产物的大小为300～800bp。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述的宿主菌为大肠杆菌TG₁。