[发明专利]用于检测瓜类蔓枯病的特异性引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，开发出一种能够快速检测瓜类蔓枯病菌的引物序列、试剂盒及其方法。

背景技术

瓜类蔓枯病由真菌子囊菌亚门泻根亚隔孢壳Didymella bryoniae(Auessw.)Rehm.，异名为甜瓜球腔菌Mycosphaerella melonis(Pass.)Chiu et Walker侵染所致，无性阶段病原菌为真菌半知菌亚门西瓜壳二孢Ascochyta citrullina Smith。蔓枯病菌以分生孢子器或子囊壳形态随病残体在土壤中，或附在种子、温室、大棚等表面上越冬、越夏。该病原菌可以侵染西瓜、甜瓜、黄瓜、西葫芦、南瓜、瓠瓜、丝瓜等葫芦科植物，在高温、高湿、通风不良的环境下容易发病，浙江及长江中下游地区春季大棚发病较重。该病流行时可使田间出现大量死藤，严重影响瓜类的产量和品质。

瓜类蔓枯病发病初期的症状与瓜类枯萎病相似，很难从症状上加以区分，并且田间容易造成多种病菌复合侵染，更加加大了病害鉴定的难度，贻误防治时机。而传统的病原菌分离和鉴定来诊断病害的方法时间长、操作繁琐，准确度低，并且难以对潜在的病原菌进行鉴定，因此亟需开发出一种能够准确、快速鉴定蔓枯病菌的分子生物学方法，对瓜类蔓枯病的潜伏期和发病初期就能进行诊断、检测和病原菌鉴定，及时有效地进行病害防治，控制病害的流行，减少经济损失，对田间病害防控具有指导意义。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是提供检测瓜类蔓枯病的引物序列，该组引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类蔓枯病进行早期预警和及时防治。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供检测瓜类蔓枯病的试剂盒，该试剂盒内引物灵敏度好特异性高，利用该组引物能对瓜类蔓枯病进行早期预警和防治。

本发明所要解决的再一个技术问题是提供相关的检测瓜类蔓枯病的方法。

本发明解决上述首要技术问题的技术方案是：一种用于检测瓜类蔓枯病的特异性引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。

本发明解决上述另一个技术问题的技术方案是：一种检测瓜类蔓枯病的试剂盒，该试剂盒包含两条引物，上游引物具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列。所述试剂盒还可以进一步包含PCR反应所需的缓冲液、酶体系以及用于提取待测样品DNA的试剂。

本发明解决上述再一个技术问题的技术方案是：一种检测瓜类蔓枯病的方法，提取待测样品DNA作为模板，利用上述引物进行PCR扩增反应，PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在469-bp的DNA条带，则检测样品中含有瓜类蔓枯病菌。

优选，所述的PCR反应的扩增体系为：1μL DNA模板（约0.4ng），引物各0.2μmoll^－1，dNTP0.2μmol l^－1,MgCl₂2mmol l^－1,1×缓冲液（上海博彩生产），聚合酶1.5U个单位，双蒸水补足至25μL。

优选，所述的PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在1×TAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。

研究表明，植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征，由于形态特征容易受到培养条件和其他因素的影响，给真菌的分类鉴定工作带来困难。而病原真菌的基因组DNA遗传稳定，不易受环境影响，而且在真菌生活史的任何阶段都能获得。真菌的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，简称ITS)在绝大多数的真菌中表现为种内相对一致，种间差异比较明显。因此利用瓜类蔓枯病菌的ITS序列可以对该病原菌进行分子鉴定，用于区别瓜类上其他病原菌。

根据瓜类蔓枯病菌的ITS序列，设计引物Db-F和Db-R，对含有蔓枯病菌DNA的样品进行扩增，可以得到469-bp的条带，对含有其他真菌DNA的样品进行扩增，都不能扩增出任何产物。

与常规的瓜类病害的鉴定技术相比，本发明根据瓜类蔓枯病菌的ITS序列，设计了上述两条特异性引物，能用来快速、准确、便捷地鉴定样品中蔓枯病菌，该鉴定方法为建立病原菌的分子监测和病害的快速诊断技术奠定基础，对植物病害的防治具有重要的意义。

附图说明