[发明专利]一种测定木薯叶片中蔗糖磷酸合成酶酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蔗糖合成酶酶活性的方法，具体是一种测定木薯叶片中蔗糖磷酸合成酶酶活性的方法。

背景技术

木薯以块根的形式储存大量淀粉，是重要的淀粉来源。木薯叶片光合产物主要以蔗糖的形式存在并向外输出,控制叶片中蔗糖合成的酶是蔗糖磷酸合成酶(SPS)，该酶是以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为供体、以6-磷酸果糖(F-6-P)为受体的糖转移酶。一般认为，SPS/Suc-6-Pase系统催化的蔗糖合成过程是叶片蔗糖合成的主要途径，运输到块根中的光合产物最初以蔗糖的形式存在,其后降解生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和果糖后才能被用来合成淀粉。木薯器官中蔗糖磷酸合成酶活性的测定受多种因素影响，由于木薯器官本身存在大量的光合产物―――蔗糖，远远高于测定酶活性过程中短时间内生成的少量蔗糖的量，因此木薯器官酶提取液中原有大量蔗糖的存在，干扰了酶活性测定过程中生成蔗糖的检出。寻找一种操作相对简单，测定结果可靠、重现性好，不同样品间可比性强的木薯器官中蔗糖磷酸合成酶酶活性方法，对研究木薯淀粉合成机理具有重要意义。

中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会主编的《现代植物生理学实验指南》（1999年）第126页“蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性的测定”（於新建）采集的材料用提取缓冲液A（100mmol／L，pH=7.0的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、2mmol／L EDTA-Na₂、20mmol／L巯基乙醇、2％乙二醇）在冰浴中提取后，用4层纱布过滤弃残渣，7000×g离心30min,取上清液用硫酸铵分步沉淀，收集30％～40％饱和度的硫酸铵沉淀部分，复溶于缓冲液B（20mmol／L，pH=7.0的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、2mmol／L EDTA-Na₂、5mmol／L巯基乙醇、10％乙二醇）中透析过夜，中间换透析缓冲液一次，经27500×g离心10min，上清液定容到5mL即得测定用酶液。酶活性测定方法采用间苯二酚显色反应法测定反应生成的蔗糖量。酶液前处理包括硫酸铵分级沉淀和透析，硫酸铵分级沉淀操作复杂，不易控制，操作时间较长。本发明对提取缓冲液进行改良，主要是加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），显著提高蛋白酶的提取溶出效果；对透析缓冲液也进行改良，大大降低乙二醇的用量，有效避免透析过程中酶液的沉淀。

发明内容

本发明为克服现有方法的缺陷，提供一种测定木薯器官中蔗糖磷酸合成酶的方法，该方法采用改良的酶液提取缓冲液提取粗酶液后，在改良的透析缓冲液中通过透析去除粗酶液中糖类物质、能够有效消除木薯器官粗酶液中高本底蔗糖含量对后续蔗糖磷酸合成酶酶活性测定的干扰，可以提高蔗糖磷酸合成酶酶活性测定的灵敏度和可靠性。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种测定木薯叶片中蔗糖磷酸合成酶酶活性的方法，用新鲜木薯叶片提取酶液后，通过透析袋脱糖，再测定酶活性。具体操作步骤如下：

1.材料采集与保存：

采集新鲜的木薯叶片，迅速放入低温容器中，如果不能马上进行测定，则用液氮研磨后置于－80℃低温冰箱中保存待用。

2.酶液提取：

取1g左右预冷的木薯叶片，加少量石英砂和5mL提取介质于研钵中快速研磨成均匀糊状，洗净研钵后，倒入离心管中，在低温冷冻超速离心机上12000r／min离心15min，取上清液，弃沉淀,以上提取过程均在4℃下进行；所述提取介质组成为：100mmol／L，pH=7.2的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、l mmol／L EDTA-Na₂、10mmol／Lβ-巯基乙醇、体积浓度2％乙二醇、重量浓度1％聚乙烯吡咯烷酮。

3.酶液透析脱糖：

取上清液2.5mL装入透析袋中，透析袋置于透析缓冲液中过夜，透析缓冲液组成为：20mmol／L、pH=7.2的Tris-HCl，2.5mmol／L MgCl₂，l mmol／L EDTA-Na₂，5mmol／Lβ-巯基乙醇，体积浓度1％乙二醇，期间更换透析缓冲液1次，每次用125mL。以上过程透析过程在4℃下进行。透析后酶液用于酶活性测定。

4.蔗糖磷酸合成酶的活性测定：