[发明专利]一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蔗糖合成酶酶活性的方法，具体是一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法。

背景技术

木薯以块根的形式储存大量淀粉，是重要的淀粉来源。蔗糖是重要的光合作用产物，是体内运输的主要物质。木薯叶片中的蔗糖合成酶是木薯淀粉合成过程中的关键酶之一，蔗糖合成酶既能够催化蔗糖合成又能够催化蔗糖分解，是控制库强与库活性的关键之一，其活性高则合成淀粉的底物就充足。木薯叶片中蔗糖合成酶活性的测定受多种因素影响，由于木薯叶片本身存在大量的光合产物―――蔗糖，远远高于测定酶活性过程中短时间内生成的产物蔗糖的量，因此木薯叶片酶提取液中原有大量蔗糖的存在，干扰了测定过程中反应生成的少量蔗糖的检出。寻找一种操作相对简单，测定结果可靠、重现性好，不同样品间可比性强的木薯叶片中蔗糖合成酶活性测定方法，对研究木薯淀粉合成机理具有重要意义。

中国科学院上海植物生理研究所、上海市植物生理学会主编的《现代植物生理学实验指南》（1999年）第126页“蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活性的测定”（於新建）采集的材料用提取缓冲液A（100mmol／L，pH=7.0的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、2mmol／L EDTA-Na₂、20mmol／L巯基乙醇、2％乙二醇）在冰浴中提取后，用4层纱布过滤弃残渣，7000×g离心30min,取上清液用硫酸铵分步沉淀，收集30％～40％饱和度的硫酸铵沉淀部分，复溶于缓冲液B（20mmol／L，pH=7.0的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、2mmol／L EDTA-Na₂、5mmol／L巯基乙醇、10％乙二醇）中透析过夜，中间换透析缓冲液一次，经27500×g离心10min，上清液定容到5mL即得测定用酶液。酶活性测定方法采用间苯二酚显色反应法测定反应生成的蔗糖量。酶液前处理包括硫酸铵分级沉淀和透析，硫酸铵分级沉淀操作复杂，不易控制，操作时间较长。本发明对提取缓冲液进行改良，主要是加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），显著提高蛋白酶的提取溶出效果；对透析缓冲液也进行改良，大大降低乙二醇的用量，有效避免透析过程中酶液的沉淀。

李建国[荔枝果实成熟期间糖积累和糖代谢相关酶活性变化。华南农业大学学报(自然科学版)，2003，24（2）：87－88］测定荔枝果实中蔗糖合成酶活性中，粗酶液的提取：取约4.0g果肉+10mmol／L Tris-HCl(pH7.0)缓冲液[内含5mmol／L MgCl₂，1mmol／L DTT，φ(BSA)=0.1％，φ(TritonX—l00)=0.05％冰浴下研磨匀浆，9000r／min下离心10min，倒出上清液，取2mL过Sephadex G-25柱脱糖，收集洗脱液中富含蛋白质的部分作为粗酶液。酶液前处理采用Sephadex G-25柱脱糖，洗脱、收集过程操作复杂，操作时间长，操作过程需要在低温层析柜中进行。

发明内容

本发明为克服现有技术的缺陷，提供一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法。该方法采用改良的酶液提取缓冲液提取粗酶液后，在改良的透析缓冲液中通过透析去除或显著减少粗酶液中糖类物质，能够有效消除木薯器官粗酶液中高本底蔗糖、葡萄糖含量对后续蔗糖合成酶酶活性测定的干扰，可以提高蔗糖合成酶酶活性测定的灵敏度和可靠性。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种测定木薯叶片中蔗糖合成酶酶活性的方法，该方法包括木薯叶片中蔗糖合成酶合成方向与分解方向酶活性的测定，用新鲜木薯叶片提取酶液后，通过透析袋脱糖，再测定酶活性，具体操作步骤如下：

1.材料采集与保存：采集新鲜的木薯叶片，迅速放入低温容器中，如果不能马上进行测定，则用液氮研磨后置于－80℃低温冰箱中保存待用。

2.酶液提取：取1g左右预冷的木薯叶片，加少量石英砂和5mL酶液提取缓冲液，其组成为：100mmol／L，pH=7.2的Tris-HCl、10mmol／L MgCl₂、1mmol／L EDTA-Na₂、10mmol／Lβ-巯基乙醇、体积浓度2％乙二醇、重量浓度l％聚乙烯吡咯烷酮，于研钵中快速研磨成均匀糊状，洗净研钵后，倒入离心管中，在低温冷冻超速离心机上12000r／min离心15min，取上清液，弃沉淀,以上提取过程均在4℃下进行。