[发明专利]一种利用温度诱导双水相体系分离纯化绿原酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用温度诱导双水相体系分离纯化绿原酸的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

绿原酸，是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是苯丙素类化合物。在植物金银花、杜仲中含量较高，易溶解于水、乙醇、丙酮等有机溶剂中，传统提取方法用异戊醇法，利用其酸性提取。由于绿原酸为咖啡酸与奎宁酸形成的脂，用酸碱萃取时易水解，产率不高。

专利文献CN101781211A公开了一种葵花粕中绿原酸提取方法，该方法将葵花粕粉碎，加入浓度为1％的纤维素酶和浓度为5％的蛋白酶，纤维素酶与蛋白酶酶液比为4∶1，葵花粕与两种酶液比为1∶8，调pH值为4，酶解时间为1.2h，酶解温度为49℃；再用pH值为3～6的45％～55％乙醇溶液浸提，使葵花粕中的绿原酸充分溶解在浸提液中，并冷却至室温；然后，再用大孔树脂法常规处理，经吸附、洗脱、干燥等工艺制得绿原酸，绿原酸得率可达到1.91％。

专利文献CN101781211A公开了一种从中药杜仲叶中制备总黄酮、绿原酸提取工艺，采用碱性蛋白酶-复合风味酶双酶酶解、膜分离和喷雾干燥技术得到绿原酸产品。专利文献CN102476996A公开了一种金银花中绿原酸的提取工艺，利用乙醇回流法对金银花中的原绿酸进行了提取，其工艺步骤为：微波处理，在装有冷凝管的250mL微波专用容器中装入金银花，预浸泡时间为8～24h，设定微波功率为600～800W，辐射时间为1～3min，启动微波炉，提取结束后，合并提取液，浓缩干燥，得到粗提物；酶解提取，向粗提物中加入0～3.0％的酶解液，酶解温度为25～60℃，酶解时间为1～4h；加入料液比为1∶8～1∶12的乙醇，乙醇的浓度为65～75％，回流浸提0.5～1.5h；在绿原酸粗提液中加入料液比为1∶2～1∶5的水，沉淀、过滤、滤液浓缩干燥，得到成品。

双水相萃取技术是一种新型的分离技术，亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相体系，通过被分离物在两相中分配不同，便可实现分离。该技术自研究开发以来，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。双水相萃取技术设备投资少，操作简单，且不存在有机溶剂残存问题，因此在天然药物分离与提取中也有良好的应用前景。但是，由于聚合物回收困难，所以在一定程度上阻碍了双水相技术的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用温度诱导双水相体系分离纯化绿原酸的方法，该方法工艺简单，不使用有毒有机溶剂，所制备的绿原酸纯度高。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用温度诱导双水相体系分离纯化绿原酸的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取绿原酸粗品：将杜仲叶粉碎后放入提取罐中，向其中加入5～7倍重量的水，加热回流1.5～2h，过滤，滤液浓缩至浸膏，即为绿原酸粗品；

(2)双水相分离：将环氧乙烷-环氧丙烷共聚物和水按体积比1～3∶1～4混合，然后向其中加入盐，混合均匀，所得溶液中盐的浓度为0.05～0.15g/mL，向溶液中按2.0～5.0mg/mL的量加入绿原酸粗品，混合均匀后，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，分离水相和富含环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的有机相，绿原酸在有机相富集，杂质在水相富集；

(3)温度诱导双水相分离：将步骤(2)得到的有机相在50～70℃水浴10～30min，溶液自动分成两相，以转速为1000～2000r/min离心分离3～5min，分离有机相和水相，绿原酸在水相富集，环氧乙烷-环氧丙烷共聚物在有机相富集并得以回收；

(4)浓缩干燥：将步骤(3)得到的水相冷却至室温，放置过夜，析出结晶，过滤得到绿原酸纯品。

在本发明的方法中，常温下环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EOPO)与盐水溶液形成双水相体系，将绿原酸富集到EOPO相。由于EOPO具有较低的浊点，升高EOPO相温度，当温度上升至EOPO的浊点温度以上时，溶液自动分成水相和有机相，绿原酸再次分配到水相，而富含EOPO的有机相得以回收。

其中，所述步骤(2)中的环氧乙烷-环氧丙烷共聚物的平均分子量优选为2000～2870。所述的盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或无水硫酸钠。所述步骤(2)中环氧乙烷-环氧丙烷共聚物与水的体积比优选为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶3、3∶2或3∶4。

在温度诱导双水相分离过程中，操作环境始终保持在EOPO的浊点以上的温度，即离心分离过程中的体系温度保持在50～70℃，优选控制为60℃，离心分离过程可以分两次操作。

本发明的优点在于：