[发明专利]一种SCD1多肽及抗鹅SCD1多肽多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种SCD1多肽及抗鹅SCD1多肽多克隆抗体的制备方法，这种抗体主要用于天然蛋白抗原的检测。

背景技术

硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase，SCD1）是细胞合成单不饱和酸的限速酶，催化饱和脂肪酸的软脂酰辅酶A脱氢，其首选底物是软脂酰辅酶A和硬脂酰辅酶A，分别转化生成棕榈酸和油酸。SCD1基因也是瘦素作用的目的基因之一，在体内脂质代谢中起到中心调节作用。目前包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、绵羊、山羊猪和牛、鸡鹅等SCD基因都已被分离鉴定出来。

利用水禽（鸭和鹅）生产的肥肝质地细嫩，口味鲜美，更重要的是其中的富含对人体有益的不饱和脂肪酸，因而被誉为世界三大美食之一。其中鹅肥肝因形大、质优、价高，而格外受到人们的喜爱。肝脏在人和动物脂肪代谢过程起到重要作用，正常情况下肝脏内脂肪处于动态平衡状态，保持肝内脂肪含量正常恒定。在某些特殊状态下，这种平衡被打破很可能造成肝脏脂肪代谢紊乱，本实验室前期通过对鹅填饲过程中差异表达基因和蛋白的筛选，结果表明SCD1在填饲前后鹅肝脏中表达变化差异显著，暗示SCD1可能在鹅肥肝形成过程中起到重要作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产成本低、特异性好、效价高，可与细胞内源性SCD1蛋白特异性结合反应，能够满足免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附等试验需求的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体及其制备方法。

本发明目的的实现为：所述的SCD1多肽的氨基酸序列为：HLLQEEEFSSASST，如SEQ ID NO.1所示。

所述的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体制备方法，合成SEQ ID NO.1所示序列，在其N端增加一个半胱氨酸得N端修饰肽，将N端修饰肽与载体蛋白得到交联的多肽，用交联的多肽免疫动物，收集免疫新西兰兔血液制备抗血清，从血清中分离纯化得到IgG。

本发明方法中所述载体蛋白为匙空血蓝蛋白（KLH）。N端修饰肽通过交联剂与载体蛋白进行交联，形成交联肽。交联的多肽与免疫佐剂混合乳化后，在新西兰兔背部皮下多点注射，共四次免疫。

上述方法中，经过硫酸铵沉淀、蛋白A亲和纯化及肽亲和纯化从抗血清中分离得到高纯度的IgG。

具体的步骤如下：

步骤一：多肽序列分析与设计：经DNAStar软件对SCD1（GenBank：HQ197924）蛋白氨基酸序列分析后，确定SCD1蛋白N末端4-17位14个氨基酸作为其抗原表位，氨基酸序列为HLLQEEEFSSASST。为保证多肽交联载体蛋白以及肽亲和纯化，在N端添加一个半胱氨酸，故最终合成多肽序列为CHLLQEEEFSSASST(N端修饰肽，SEQ ID NO.2)；

步骤二：SCD1的N端修饰肽肽合成：使用ACT396多肽自动合成仪合成SCD1N端修饰肽；

步骤三：N端修饰肽与载体蛋白交联：N端修饰肽与载体蛋白KLH通过Sulfo-SMCC交联法进行交联。

步骤四：多肽免疫与抗血清制备：将乳化后的SCD1多肽-KLH复合蛋白（即交联肽）于新西兰兔背部皮下免疫注射，共进行四次免疫；收集、分离得到的含有兔抗鹅SCD1多肽抗体的血清;

步骤五：使用Sulfo-link-gel多肽交联为层析填料，半胱氨酸封闭，制备多肽亲和层析柱；将步骤四获得的含有兔抗鹅SCD1多肽抗体的血清加入制备好层析柱中，置于4℃过夜孵育后，洗脱抗体，即得到兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体。

所述的兔抗鹅是通过以下步骤鉴定的：

免疫印迹：将所获得的SCD1多肽多克隆抗体作为一抗，采用标准的免疫印迹方法，确认该抗体能够与变性后的天然SCD1蛋白相互作用，可以用于免疫印迹试验。本发明制得的兔抗鹅SCD1多肽多克隆抗体，效价在1：240000以上。

本发明制备的抗体具有生产成本低、特异性好、效价高，可与细胞内源性SCD1蛋白特异性结合反应，能够满足免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附等试验需求，用于建立体外免疫分析和SCD1蛋白生物学功能研究，具有重要的理论和实践价值。

附图说明

图1为本发明的兔抗SCD1多肽多克隆抗体检测不同填饲阶段鹅肝脏SCD1蛋白表达的特异性结果图；1为填饲0天；2为填饲10天；3为填饲19天。

具体实施方式

实施例一：鹅SCD1抗原肽分析与设计