[发明专利]苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

 本发明涉及根结属线虫的检测技术，具体涉及苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒。

背景技术

根结属线虫（Meloidogyne Goeldi，1887）为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。 苹果根结线虫Meloidogyne mali Itoh, Ohshima & Ichinohe, 1969为宁波口岸首次从来自日本的鸡爪槭中截获。虽然我国上世纪90年代曾报道福建漳州的柑橘及河南郑州的杨树上发现苹果根结线虫，但上述报道均未对发现的根结线虫种类进行详细、准确地描述和鉴定，况且柑橘及杨树都不是公认的苹果根结线虫寄主，其鉴定是否准确还有待证实。苹果根结线虫寄主植物主要为木本植物，包括苹果、海棠果、三叶海棠、葡萄、樱桃、日本栗、鸡爪槭、桑树、玫瑰、榆树、无花果、覆盘子、枸树等。在日本，该种线虫造成苹果产量损失可高达40％，它还是日本桑树最重要的病原线虫，可造成桑树变矮、叶片减小，严重时导致桑树死亡。我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对根结线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但多数只能针对南方、花生、爪哇等几种常见的根结线虫进行鉴定，如公开号为CN1661108的发明专利申请，就公开了爪哇根结线虫的检测引物及检测方法。目前还未公开苹果根结线虫的分子生物学方面的检测报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒。

本发明系选择参考GenBank中苹果根结线虫的核糖体ITS基因（Internal Transcribed Spacer），使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp）设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估（以苹果根结线虫的DNA为模板，南方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物），筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明的苹果根结线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，所述一对特异性引物的核苷酸序列分别为：

上游引物： 5’- GGGACCGACG GCTTAGTG-3’      

下游引物： 5’- CCGTTACACG ACGAGAGTC-3’。

    苹果根结线虫的PCR检测试剂盒，试剂盒的组成成份如下：无Mg²⁺的10×PCR缓冲液，浓度为25 mM的MgCl₂溶液，浓度为0.1 mM的dNTP溶液，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液。

与现有技术相比，本发明的优点是苹果根结线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGGACCGACG GCTTAGTG，下游引物的核苷酸序列： CCGTTACACG ACGAGAGTC。该特异性引物对苹果根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为250 bp，对其它根结线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、苹果根结线虫的PCR检测试剂盒

100次或200次等的×50μL反应体系试剂盒，50μL反应体系组份如下：无Mg²⁺的10×PCR缓冲液5.0μL，浓度为25 mM的MgCl₂溶液5.0μL，浓度为0.1 mM的dNTP溶液4.0μL，浓度5 U/μL 的Taq酶溶液0.6μL，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0μL。无Mg²⁺的10×PCR缓冲液，Taq酶液，dNTP液购于宝生物工程（大连）有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为GGGACCGACG GCTTAGTG的引物，下游引物溶液含有核苷酸序列为CCGTTACACG ACGAGAGTC引物。