[发明专利]一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

胃蛋白酶原（PG）是胃粘膜细胞分泌的蛋白水解酶原，它属于天门冬氨蛋白酶家族。在PH为1.0～5.0的酸性条件下，可以自动水解成胃蛋白酶。根据生化免疫学特性上可以分为PG I（PGA），PG II（PGC）两大类，有7组胃蛋白酶同工酶原，1～5组分免疫原性近似，称为PG I，主要由胃腺主细胞的黏液颈细胞分泌；组分6～7被称PG II，来源于胃体胃底黏膜泌酸腺，胃贲门腺，胃窦幽门腺和远端十二指肠Brunner氏腺，前列腺和胰腺也有少量产生。分泌后的PG大部分进入胃肠经过胃蛋白酶或胃酸水解，仅有1%的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环，再通过肾排入尿中。

通常情况下，这1%的PG在血液中非常稳定。血清中PG I和PG II可以反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。PG I是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，胃酸分泌增多PG I升高，分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PG I降低。PG II与胃底粘膜病变的相关性较大（相对于胃窦粘膜），其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关。PG I/II比值进行性降低与胃粘膜萎缩进展相关。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变。因此，监测血清中PG的浓度可以作为监测胃黏膜状态的手段。

胃蛋白酶原（PG）在血清中的变化可反应胃黏膜变化，进一步提示胃部疾病的变化历程，包括：浅表性胃炎，胃粘膜糜烂溃疡，萎缩性胃炎，胃癌。由此在国外发达国家已经利用胃蛋白酶原作为体外诊断标志，进行于胃癌的大面积普查，使癌症的提前诊断率提高到90%，所以运用胃蛋白酶原（PG）在我们国家进行大面积人群普查非常有意义。

当前，国内外胃蛋白酶原的诊断试剂有酶联免疫法，化学发光法以及用于全自动生化分析仪的胶乳增强免疫比浊法，现市场上的《胃蛋白酶原检测试剂盒》的原料主要有人胃蛋白酶原免疫后得到的PG抗体以及可制备成试剂盒校准品的胃蛋白酶原。虽然说胃蛋白酶原可以从人的胃部组织，尿液，精液等材料提取，但是从天然材料中提取困难重重，导致来源和数量受到了很大的限制。相对于PG I，PG II的天然提取更不易，采用基因工程的方法制备胃蛋白酶原不失为一个捷径。现国内外就有用基因工程方法在大肠杆菌和酵母中表达了PG I和PG II：国内如徐晓晶等用酵母表达了人胃蛋白酶原C，国外如Ajamaluddin Malik等在大肠杆菌胞周质表达了融合的天然胃蛋白酶原A，也有Takashi Aoki等同时表达了人胃蛋白酶原A和C，可以在免疫分析试剂盒中作为试剂盒校准品使用。

然而胃蛋白酶原PG II有两个同工酶，它们在氨基酸序列上有所差异，并不完全一致，所以在胃蛋白酶原诊断试剂盒中，以多抗为原料的试剂中可能缺少一些针对另一同工酶的多抗，而以单抗为原料的试剂中可能缺少针对另一同工酶的更灵敏的单抗。在现有的文献记录中，也未曾报道过用于制备可同时产生针对于这两种同工酶多抗或是可以同时筛选针对于两同工酶单抗的胃蛋白酶原II嵌合蛋白。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白。

本发明的另一个目的是提供一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，该方法用于制备可同时产生这两种同工酶多抗或是同时筛选两同工酶单抗的嵌合蛋白。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，

氨基酸序列为SEQ ID NO6；核苷酸序列为SEQ ID NO5。

本发明还提供了一种上述重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，包括以下步骤：以合成的人胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列为模板，经过PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列，构建重组表达质粒，筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株，扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白，通过纯化获得重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列为SEQ ID NO7，同工酶2核苷酸序列为SEQ ID NO8。

作为一种优选的技术方案，所述PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列包括以下步骤：