[发明专利]一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白、制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，其特征在于，

氨基酸序列为SEQ ID NO6；核苷酸序列为SEQ ID NO5。

2.根据权利要求1所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以合成的人胃蛋白酶原II两同工酶的基因序列为模板，经过PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列，构建重组表达质粒，筛选出的阳性克隆质粒转化到表达宿主细胞，筛选高效表达重组嵌合蛋白菌株，扩大培养细胞及诱导表达嵌合蛋白，通过纯化获得重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白，同工酶1核苷酸序列为SEQ ID NO7，同工酶2核苷酸序列为SEQ ID NO8。

3.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列包括以下步骤：

将人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和下游引物P2进行第一次PCR扩增；人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和下游引物P4进行第二次PCR扩增；将上述扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2进行第三次PCR扩增，获得PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列。

4.根据权利要求3所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1的基因序列为5，TTCCATGGCAGTTGTCAAAGTTCCACTGAAGAAGTTT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2的基因序列为5，GCTTCCACCGCCGCCTGCAGCAGTAGCGAAAC3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3的基因序列为5，GGCGGCGGTGGAAGCCTGGTTCTGGAATCTTCT3，；

所述人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4的基因序列为5，TTCTCGAGGGCACCAGAATGATGCTGACTACGTG3，；

所述第一次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶1上游引物P1和人胃蛋白酶原II同工酶1下游引物P2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min20s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收；

所述第二次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P3和人胃蛋白酶原II同工酶2上游引物P4各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃20s，63℃20s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1.2%琼脂糖胶回收；

所述第三次PCR扩增的条件为：在50ul扩增体系中取扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶1和扩增后的人胃蛋白酶原II同工酶2各0.5ul，扩增条件为：94℃预热5min，94℃45s，60℃45s，72℃1min30s，30个循环，72℃延伸10min；PCR完成后，用1%琼脂糖胶回收获得PCR拼接的嵌合蛋白编码基因序列。

5.根据权利要求2所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述构建重组表达质粒包括以下步骤：

把PCR拼接取得嵌合蛋白编码基因序列用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，同时把表达载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，将酶切的目的基因与表达载体连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，PCR筛选阳性克隆质粒，用双酶切进一步验证其正确性。

6.根据权利要求5所述的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET-28a。