[发明专利]CeDGAT1基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种二酰基甘油酰基转移酶基因DGAT1及其应用。具体地，涉及该基因序列的获得和酵母表达载体的构建，以及其能大幅度提高酵母脂肪酸含量方面的研究。

背景技术

微藻是遍布全球水体的浮游植物，具有产能大、无污染、可再生、易培养、含有较多的脂类物质等优点，在能量转化和碳元素循环中具有重要的作用。有些微藻把光合作用产物转化为脂肪酸，进一步合成三酰甘油(TAG)，在细胞中以油滴的形式贮藏起来。微藻细胞中的三酰甘油可达到干重的20％-50％，提取后通过转酯化后可转变为脂肪酸甲酯，即生物柴油。此外，微藻还具有较大的食用和化学利用价值。基于以上多方面的优势，微藻被认为是当今最有开发前途的能源原料之一^[1-3]。小球藻(Chlorella)是微藻中的一类，属于绿藻门小球藻属，是一种真核单细胞微藻，直径大约3-8微米。小球藻繁殖速度很快，含有丰富的营养元素，例如蛋白质、油脂、多不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、食物纤维、核酸及叶绿素等，还含有多种生物活性物质，例如糖蛋白、多糖。小球藻可以进行光自养培养、也可以进行无光照的异养培养，而且是少数几个可用于大规模培养的微藻。所以，小球藻是进行能源微藻研究的一个潜在的理想材料^[4]。

三酰甘油(TAG)在大部分生物体中都是最主要的储藏脂类，包括脊椎动物、油料作物、真菌以及微藻。在微藻中，TAG一般在逆境条件下积累于油体^[5]。首先，在质体中，乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶(ACCase)的作用下形成丙二酸单酰-CoA；丙二酸单酰-CoA进行逐步的缩合反应，从二碳单酰基载体蛋白(ACP)开始，依次把二碳单位带入脂酰链，经过数次循环聚合以及去饱和反应后形成不同碳链长度的酰基-ACP，然后在酰基辅酶A合成酶(ACS)的作用下合成酰基辅酶A，并从质体转移到内质网或胞质中，成为真核生物内质网三酰甘油合成的底物。游离脂肪酸被酯化生成酯酰辅酶A(CoA)后，在膜结合的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二酰甘油酰基转移酶(DGAT)3种酰基转移酶作用下，依次把甘油骨架第一至第三位经酰基化合成三酰甘油，该生物合成过程就是通常所说的Kennedy途径^[6-7]。

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)催化TAG合成途径即Kennedy途径的最后一步，也是该途径唯一的限速酶。DGAT被认为是在TAG合成过程中起主要作用的酶，普遍存在于所有已研究的真核生物中。到目前为止，共发现3类DGAT基因家族，包括DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族^[8-9]。Cases等^[10]在小鼠中克隆了第一个DGAT1基因后，Hobbs等^[11]在拟南芥中克隆了DGAT1基因，该基因在拟南芥中仅有一个拷贝。AtDGAT1基因在野生型拟南芥中过量表达研究发现，DGAT1转录水平和活性明显提高(10％-70％)，油脂积累增加，种子平均重量增加^[12]。随后，油菜、蓖麻、烟草、大豆、玉米、橄榄、红花、向日葵、火焰卫矛和百脉根等植物中DGAT1基因也相继被克隆^[13-16]。近年来，Lock^[17]等通过将一个BnDGAT1反义基因转化到油菜DH12075中发现，DGAT1基因的表达量、总体DGAT蛋白的酶活性和种子的含油量都有明显的下降，同时，种子的产量以及萌发率也比转化前降低，而且种子发育严重畸形。这些结果表明，DGAT除了在总油脂形成中有重要作用以外，它还影响种子的正常发育，但是具体的调控机制目前还不清楚。目前，在一些微藻中也克隆到了DGAT1基因，Boyle等人在衣藻中克隆了一个DGAT1基因^[18]，Guiheneuf等在三角褐指藻中也克隆到DGAT1基因^[5]。莱茵衣藻和三角褐指藻中DGAT1基因的功能已被验证和具体阐述。DGAT2基因家族的成员在动物，植物和酵母中都存在，并且与DGAT1基因家族没有明显的同源性。目前对DGAT2的研究较少，仅在拟南芥(GenBank收录号NM115011)、油菜(GenBank收录号AY916129)、蓖麻少数植物中克隆出来。近两年在莱茵衣藻^[19-20]和Ostreococcus tauri^[21]中也有报道。Saha^[8]等人从发育中的花生子叶细胞质中克隆得到了DGAT3基因，该基因与DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10％，但是其编码的蛋白具有类似DGAT蛋白功能基序，而且与TAG合成密切相关。此外，有证据表明TAG的形成还存在另外一条途径，即由磷脂：甘油二酯脂酰转移酶(PDAT)利用磷脂催化甘油二酯(DAG)合成TAG和溶血磷脂的反应。无论是在植物还是微藻中，对PDAT基因的研究均不多。