[发明专利]一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达NS1蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术，公开了家蚕生物反应器可视化跟踪表达系统的构建流程及其应用。具体而言，特指一种重组芽生型病毒粒子BV的制备方法、及利用这种病毒在家蚕生物反应器中快速、高效表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NS1，为NS1蛋白的后续功能和结构研究奠定基础，该方法同样也适用于其它外源基因以及具有重要功能的重组蛋白药物的表达。

背景技术

杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)是当今基因工程四大表达系统之一，所利用的杆状病毒表达载体大都是选择苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)或者家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。在众多的表达系统中，鉴于外源基因在原核表达系统中的表达产量相对较高，因此在表达外源基因时往往首选原核表达系统，但鉴于表达产物是以包涵体形式存在，产物没有生物活性且缺乏翻译后修饰，限制了该系统的进一步应用；单细胞酵母表达系统是一种真核表达系统，但其只能够对表达产物进行一些简单的糖基化修饰，表达产物具有一定的生物活性；哺乳动物细胞是一种理想中的真核表达系统，具有对翻译后的产物进行加工和翻译，所产生的蛋白在活性方面远胜于其它真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但由于该系统中的外源蛋白表达量偏低，并且培养细胞所需要的成本很高，目前还难以满足大规模的实际应用。而BEVS中所表达的产物不仅具有正确的折叠，也具有翻译后加工、糖基化和磷酸化修饰等特性，所表达的产物在生物活性、抗原性和免疫原性都接近于其对应的天然产物，这些特性使BEVS成为一种应用广泛的表达系统(Kato et al.,Appl Microbiol Biotechnol,2010,85:459-470；Prabhakar et al.,Mol Biotechnol,2010,46:80–89)。

由于BEVS具有众多独特的特性以及安全性好，现已广泛应用于药物研发、疫苗生产以及重组病毒杀虫剂等众多研究领域中，是一种非常理想的真核表达系统，但该表达系统需要在培养的昆虫细胞中表达外源蛋白，所需费用昂贵，不适于大规模表达外源蛋白，而利用家蚕作为生物反应器则可以克服这个不利条件。家蚕是我国的一种重要经济昆虫，主要以桑叶为食，容易大规模饲养，所需要的培养设备简单，成本低廉，生产周期短，非常适于大规模表达具有重要功能的重组蛋白；另外，家蚕全基因组序列测定的完成(Xia et al.,Science,2009,326:433–436.)，也有助于我们对家蚕进行遗传改造，由此可以培育出更有利于外源蛋白表达的新品种，到目前为止，全球至少已有30个实验室在利用家蚕作为生物反应器开展蛋白药物方面的研究，自1985年首次利用家蚕生物反应器高效表达了人干扰素-α(IFN-α)(Maeda et al.,Nature,1985,315:592–594)以来，30多种重组蛋白包括人生长因子、人2,6-唾液酸转移酶、人粒-巨噬细胞集落刺激因子以及人抗白蛋白免疫球蛋白G1等功能蛋白药物在家蚕生物反应器中都成功地获得了表达(Kadono-Okuda et al.,Biochem Biophys Res Commun,1995,213:389–396;Ogata et al.,BMC Biotechnol,2009b,9:54;Chen et al.,J Biotechnol,2006,123:236–247;Park et al.,J Biotechnol,2009,139:108–114)，基于家蚕生物反应器巨大的商业前景，世界上很多国家都加大投资力度对家蚕生物反应器进行研发。