[发明专利]表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基及其配制方法和发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基及其配制方法和发酵工艺。

背景技术

我国是乙型肝炎高流行区，每年平均报告发病人50多万例，而接种乙肝疫苗是预防乙型肝炎最有效、最经济的方法。我国于1992年将乙型肝炎疫苗纳入计划免疫管理，2009年开始，国家又将乙型肝炎免费接种范围扩大至对15岁以下青少年儿童，以及医务人员、大学生和现役军人等，全国对乙肝疫苗的需求愈来愈大。如今全国各乙肝疫苗厂家均在积极通过生产技术改进与革新等提高生产效率或扩大产能，以满足因乙肝免费接种扩大到15岁以上和其他高危人群形成的突然增长的市场需求。

目前，乙肝疫苗主要是采用重组酿酒酵母菌发酵生产而得。现有的重组酿酒酵母菌发酵培养基主要组分为酵母粉、大豆蛋白胨、葡萄糖。这种培养基碳源单一、微量因子缺乏，发酵密度小、以致发酵产量与HBsAg表达水平低，难以满足乙型肝炎疫苗市场日益增长的需求。

为此，本领域内的技术人员进行了大量的研究，如何对培养基进行优化，以实现重组酵母表达乙肝表面抗原的高密度培养和目的产物的高表达方面在国内外有一些文献报道，但多限于实验室阶段，极少研究或应用于大规模生产。已经公布的CN200410005407.X，CN200410005408.4专利申请文献均采用分批流加培养技术进行重组酿酒酵母菌表达HBsAg生产，但流程控制较为复杂，且发酵周期相对较长。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基，该培养基可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表达水平，且生产过程较简单且易于控制、发酵周期短。

本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基的配制方法，该方法配制出的培养基可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表达水平，且生产过程易于控制、发酵周期短。

本发明更进一步所要解决的技术问题是：提供一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵工艺，该发酵工艺可显著提高重组酿酒酵母菌的发酵细胞量和HBsAg表达水平，且生产过程较简单且易于控制、发酵周期短。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵培养基，所述重组酿酒酵母菌为腺嘌呤缺陷型酵母菌，包括有以下组分：酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、葡萄糖12～26g/L、海藻糖10～30g/L、腺嘌呤0.05～0.2g/L。

优选地，各组分具体含量为：

酵母粉35g/L、大豆蛋白胨32g/L、葡萄糖20g/L、海藻糖10g/L、腺嘌呤0.05g/L。

优选地，各组分具体含量为：

酵母粉42g/L、大豆蛋白胨35g/L、葡萄糖17g/L、海藻糖17g/L、腺嘌呤0.1g/L。

优选地，所述重组酿酒酵母菌为腺嘌呤缺陷型酵母菌。

优选地，所述重组酿酒酵母菌为Saccharomyces cerevisiae2150-2-3（pHBS56-GAP347/33）。

相应地，本发明还公开了一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌发酵培养基的配制方法，该培养基为如上所述的表达HBsAg的重组酿酒酵母菌培养基，该方法包括以下步骤：

分别称取1个单位体积的酵母粉30～45g/L、大豆蛋白胨25～40g/L、海藻糖10～30g/L及腺嘌呤0.05～0.2g/L，混合后加入到发酵罐中，搅拌均匀后经121℃灭菌30分钟；

用注射用水对葡萄糖溶解，得到1个单位体积的葡萄糖溶液12～26g/L；

采用无菌操作将所得的葡萄糖溶液经0.2μm滤器除菌过滤后，加入到所述发酵罐中，并搅拌均匀，即得所述发酵培养基。相应地，本发明还公开了一种表达HBsAg的重组酿酒酵母菌的发酵工艺，包括以下步骤：

制备种子液；

按照如上所述的方法配制发酵培养基，在接种前标定溶氧电极的溶氧值为100%；

以10%的接种量将所述种子液接种于所述发酵培养基中发酵；

在发酵过程中分多次采用无菌操作加入除菌过滤后的葡萄糖溶液，每次加入的葡萄糖相对于发酵液的浓度为6g/L；

发酵至第48～55小时时后，终止发酵。

优选地，所述菌种为美国默克公司以DNA重组技术构建的表达HBsAg的重组酿酒酵母工作种子批菌种。

优选地，在所述发酵过程中，分多次在发酵第12、17、21小时加入所述葡萄糖溶液。