[发明专利]一种广谱抗菌多肽的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种广谱抗菌多肽的制备方法，属于生物化学和生物技术领域。

背景技术

抗生素的耐药性已成为影响抗感染治疗和畜牧业发展的严重问题，新的抗菌物质的研究和开发是解决这一问题的关键。抗菌肽作为一种重要的抗菌物质，近年来成为研究的热点。抗菌肽是一种具有抗菌活性的短肽，由细胞特定基因编码、经外界条件诱导产生，广泛存在于生物界，是天然免疫系统的重要组成部分。许多抗菌肽除了有抗菌作用外，还表现出抗病毒、抗肿瘤的活性。抗菌肽一般是阳离子两亲结构，能够特异地与带负电的细胞结合，在细胞膜上形成小孔，或破坏细胞膜结构，导致细胞死亡。其作用机理独特，不易产生耐药性；在抗肿瘤方面，许多抗菌肽具有选择性杀伤肿瘤细胞的功能，尤其是对哺乳动物正常细胞毒性较低，有望成为人类战胜癌症的新式武器，已经成为抗肿瘤药物研发的热点之一。许多具有抗肿瘤活性的抗菌肽已进行临床实验，因此抗菌肽极具开发利用价值。

自1980年第一种抗菌肽天蚕素分离以来，从细菌、真菌、昆虫、两栖类、高等植物及哺乳动物中相继发现并获得了许多具有类似性质的活性多肽。随着新技术、新方法的应用，新发现的抗菌肽数量还在持续增长。传统的抗菌肽筛选技术多依据蛋白质分离纯化方法进行逐级分离，并在分离的过程中检测各组分的抗菌活性。另外一种思路是从分离抗菌肽基因入手，再通过化学合成或基因工程的方法获得抗菌肽。从基因分离的角度进行抗菌肽的筛选和分离，是利用了已知抗菌肽的结构和功能的信息，在效率上更高一些。以上方法各有优缺点。虽然抗菌肽的种类和制备方法很多，但仍然需要研发更新、更具应用价值的广谱抗菌多肽。

发明内容

本发明的目的在于解决上述技术中的不足，提供一种具有抗多种革兰氏阳性菌、阴性菌的长效、耐热、无溶血性的新的广谱抗菌多肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术手段是：一种广谱抗菌多肽的制备方法，其步骤包括：

一、预测筛选：下载海鞘的基因组序列，寻找其中具有潜在编码功能的小开放阅读框，将这些小开放阅读框分别翻译出对应的氨基酸序列，从中筛选抗菌肽；

二、制备抗菌肽：根据步骤一中预测筛选的抗菌肽序列，利用固相合成法合成其中的部分多肽，并且使C端酰胺化，N端不含有蛋氨酸，制备抗菌肽，并进行质谱鉴定；

三、抗菌性检测：将抗菌肽用蒸馏水溶解成浓度为1mg/ml，采用琼脂糖扩散法进行抗菌活性检测；

四、溶血性检测：利用羊血红细胞检测抗菌肽的溶血作用；

五、制备广谱抗菌多肽：最终筛选到的具有广谱抗菌功能的多肽。

进一步的，所述步骤三中琼脂糖扩散法中使用的菌株为大肠杆菌、金黄葡萄球菌、四联球菌、白色假丝酵母、变形杆菌、绿脓杆菌、变异链球菌、幽门螺杆菌的一种或几种组合。

进一步的，所述步骤五中制备的多肽，其序列为：Phe Ser Leu Phe Phe Pro Tyr Ala Ala Leu Lys Trp Leu Arg Lys Leu Leu Lys Lys。

进一步的，所述步骤五中制备的多肽尤其对变异链球菌、幽门螺杆菌具有杀伤作用。

本发明的有益效果在于：本方法制备的多肽具有广谱的抗菌作用，尤其是对变异链球菌、幽门螺杆菌具有杀伤作用，而对正常细胞没有副作用；分子量小，结构简单，人工合成方便；作用持久，无溶血作用，显示其在治疗细菌性感染，特别是对变异链球菌、幽门螺杆菌感染的治疗方面具有重要应用价值。

具体实施方式

实施例1

一种广谱抗菌多肽的制备方法，其步骤包括：

一、抗菌肽的生物信息学筛选 

以海鞘2号染色体基因组序列为模板，根据抗菌肽分子量小的特点，首先利用小开放阅读框分析软件sORFfinder从基因组序列中筛选具有潜在编码功能的小开放阅读框(sORFs)。将这些sORFs分别翻译出对应的氨基酸序列，利用抗菌肽预测软件CAMP从sORFs中筛选抗菌肽。共预测到可能性超过70%的序列100余条。

二、多肽的抗菌活性鉴定

选择8个可能性超过90%、2个可能性在60-70%之间的序列，委托上海楚肽生物技术公司利用固相合成法合成，并将C末端酰胺化，合成后经HPLC纯化，纯度达到96.68%，并经质谱分析鉴定（表1）。

表1 合成多肽序列表